胃癌組織中胃癌相關成纖維細胞、胃正常成纖維細胞的分離鑒定及增殖情況觀察

封蘭蘭，孫偉，朱吉海，劉珺，趙珺，劉燕

(青海大學醫學院，西寧810016)

目前大多數腫瘤相關的研究是以單克隆細胞系和動物模型為對象進行信號通路及藥理作用等方面的報道，而忽略了腫瘤微環境(TME)對癌細胞及人體的影響。研究認為上皮性腫瘤的發生發展與慢性炎癥[1]、間質老化[2]、自噬[3]及癌相關成纖維細胞的激活[4]等TME改變密不可分。TME包括腫瘤間質細胞及細胞外基質，癌相關成纖維細胞(CAFs)是腫瘤間質細胞的重要組成部分，其可通過分泌生長因子、細胞因子及趨化因子等與腫瘤細胞產生交互作用，進而促進腫瘤的發展。CAFs是食管腺癌[5]、結直腸癌[6]預后差的重要標志。胃CAFs、胃NFs的原代培養及鑒定可為腫瘤微環境的深入研究提供實驗基礎。組織塊分離法、膠原酶消化法是常用的細胞原代培養方法。免疫細胞化學染色法是臨床常用的細胞鑒定方法。癌組織原代培養過程主要是癌細胞和成纖維細胞的生長。細胞角蛋白18(CK18)廣泛表達于腺上皮細胞，而波形蛋白(Vimentin)在上皮細胞中不表達，在間質細胞內廣泛分布。α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)是區別CAFs和NFs的重要蛋白標記物[7]。目前有關胃癌CAFs對胃癌細胞增殖、侵襲及轉移的促進作用已有較多相關報道，但胃CAFs及胃NFs的原代培養、鑒定及二者生物學特性比較的相關研究較少。本研究我們分離純化胃CAFs、胃NFs，并分析其細胞形態、細胞表型及增殖活性等方面的差異。

1 材料與方法

1.1 胃癌組織標本來源 選擇于青海大學附屬醫院手術室進行胃癌切除術的3例患者，術前均未進行放化療及其他相關治療，胃癌組織離體后，用無菌剪刀分別剪取腫瘤組織(與正常黏膜交界區的質軟腫瘤區域，避開壞死區)及腫瘤遠端胃正常黏膜組織，置于盛有含10% 雙抗的無菌F12/低糖DMEM培養基的離心管內，標記并密封后4 ℃保存備用。本研究獲得青海大學附屬醫院倫理委員會的批準，所用標本征得患者家屬的同意并簽署知情同意書。

1.2 試劑 F12培養基，低糖DMEM培養基，胰蛋白酶，青霉素/鏈霉素雙抗均購自Hyclone公司；胎牛血清、hEGF、L-谷氨酰胺均購自美國Gibco公司；Ⅱ型膠原酶及Ⅳ型膠原酶購自Biosharp公司；鼠抗CK18抗體及鼠抗Vimentin抗體均購自邁新公司，鼠抗α-SMA購自博士德公司，辣根過氧化物酶標記的抗鼠兔通用型二抗及二氨基聯苯胺(DAB)購自DAKO公司。

1.3 胃CAFs、胃NFs的分離純化

1.3.1 胃癌組織及胃正常黏膜組織處理 在超凈臺內用含10%雙抗的無菌PBS沖洗組織塊，用無菌眼科剪將組織塊剪成1 mm左右的組織塊，分成兩份，備用。

1.3.2 胃CAFs、胃NFs分離方法 取兩份組織，分別采用組織塊貼壁法、膠原酶消化法培養胃癌CAFs、胃NFs。①組織塊貼壁法 將組織塊均勻平鋪于無菌培養皿，加入少量含10%胎牛血清，1%雙抗，1% hEGF及1% L-谷氨酰胺的F12/低糖DMEM培養基(F12/低糖DMEM比例為1∶1)，使培養皿內的組織塊保持濕潤，將培養皿放入5% CO2、37 ℃細胞培養箱，4 h后加培養基至沒過組織塊，24 h后更換培養基，隔1 d換液一次。②膠原酶消化法：組織塊用含0.2% Ⅳ型膠原酶和0.1% Ⅱ型膠原酶的F12/低糖DMEM培養基37 ℃消化3 h，200目的無菌濾器過濾后離心5 min(1 000 rpm/min)，倒出上清，PBS重懸沉淀并離心兩次，將沉淀用含10%胎牛血清的培養基重懸置于培養皿內，24 h后換培養基，隔1 d換一次培養基。

1.3.3 胃CAFs、胃NFs細胞傳代及差速貼壁方法 培養皿內原代培養細胞長滿后，棄掉培養基，PBS沖洗后加入1 mL胰蛋白酶,消化細胞2～3 min，倒置顯微鏡觀察，待50%細胞變圓變亮后吸走胰蛋白酶，培養基吹打混勻細胞后置入新培養皿，細胞貼壁20 min后將培養基轉入下一培養皿，原培養皿內加入培養基；重復上述操作1次。

1.4 胃CAFs、胃NFs的鑒定方法

1.4.1 細胞形態觀察 分別取貼壁24 h、培養15 d、第4代傳代細胞，采用顯微鏡觀察培養的細胞形態。

1.4.2 細胞α-SMA、CK18、Vimentin檢測方法 采用免疫細胞化學染色法。取第4代傳代細胞，加入24孔板內培養兩到三天后，棄掉培養基，PBS沖洗兩遍，4%多聚甲醛固定細胞30 min，3 mL/L H2O2孵育10 min，5%脫脂奶粉封閉1 h；滴加鼠抗CK18抗體、鼠抗Vimentin抗體、鼠抗α-SMA抗體(1∶200)，4 ℃孵育過夜；PBS洗滌4 5 min，二抗室溫孵育30 min，DAB顯色2 min，顯微鏡觀察細胞α-SMA、CK18、Vimentin。CK18細胞質及細胞膜呈棕黃色為陽性表達、Vimentin、α-SMA細胞質呈棕黃色為陽性表達。

1.4.3 細胞增殖情況觀測 采用MTT法。分別取3份組織(GC1、GC2、GC3)分離出來的三組細胞。細胞生長至對數期時，胰酶消化細胞制成細胞懸液，細胞計數后按每孔2 000個接種于96孔板，每組重復4孔，每板設2個空白對照孔；分別于細胞貼壁 1、2、3、4、5、6 d,10 μL/孔 MTT溶液(終濃度5 mg/mL)加入待測孔，培養箱內孵育4 h，200 μL/孔二甲基亞楓(DMSO)溶解結晶，并室溫振搖15 min，490 nm處測光密度OD值，繪制細胞生長曲線。

2 結果

2.1 胃CAFs、胃NFs細胞形態 貼壁24 h時鏡下以上皮樣細胞為主，隨培養時間推移，成纖維樣細胞開始增多，上皮樣細胞相對變少。培養第15天，鏡下成纖維樣細胞較多。傳代第4代細胞，鏡下未見明顯上皮樣細胞，胃CAFs形態多樣化，大小不一，呈梭形或星狀，細胞表面可見不規則突起，排列不規整，細胞重疊生長。胃NFs細胞生長速度較慢，大小、形狀均勻一致，呈長梭形，排列規則。

2.2 細胞CK18、Vimentin、α-SMA表達情況 胃CAFs細胞存在α-SMA、Vimentin陽性表達，CK18陰性表達，胃NFs 細胞存在Vimentin陽性表達，α-SMA、CK18陰性表達。

2.3 胃CAFs、胃NFs細胞的OD值比較 不同培養時間胃CAFs、胃NFs細胞OD值比較見表1。第2～4天胃CAFs、胃NFs細胞生長速度快，處于細胞生長對數期，第5天以后胃CAFs、胃NFs細胞生長平緩，趨于穩定。

表1 不同培養時間胃CAFs、胃NFs細胞的OD值比較

注：與同來源時間NFs比較，＊P<0.05。

3 討論

CAFs作為腫瘤微環境的重要組成部分，其在腫瘤發生發展過程中的作用備受關注。研究[8]發現CAFs可通過血管抑制蛋白2(Vash2)上調EREG和IL11的表達促進胃癌的發生；通過刺激腫瘤微環境中血管的生成促進舌癌細胞的侵襲和轉移[9]；通過細胞之間的直接交互作用或分泌可溶性因子促進胰腺癌細胞增殖、存活及上皮間質轉化(EMT)[10]，且與腫瘤預后不良有關的許多標記分子均來自CAFs[11]。Hanley等[12]發現抑制NADPH氧化酶4(NOX4)后可阻止成纖維細胞內活性氧簇的產生，從而抑制其分化為CAFs。NOX4抑制劑具有抑制糖尿病腎病患者腎臟纖維化的作用，并且在Ⅱ期臨床試驗中取得成功，但其在胃癌等腫瘤中的臨床應用還未見報道。胃癌CAFs的原代培養和分離純化將為腫瘤微環境與胃癌細胞之間的作用機制研究及臨床腫瘤藥物的靶標研究提供良好的基礎。

本課題擬通過對胃癌新鮮組織標本的培養獲得原代胃癌CAFs和胃NFs，為后期研究提供可靠的細胞模型。原代培養過程中，組織塊貼壁法和膠原酶消化法均能成功獲得原代胃癌CAFs及胃NFs。經比較，我們發現組織塊貼壁法經濟簡單，但是組織塊貼壁后加液時間及加液量較難把控，掌控不好則可能導致組織脫離瓶底或細胞存活率低；膠原酶消化法成本較高，不適用于大量的原代細胞培養實驗，但是可操作性強，細胞容易貼壁。

通過形態學觀察，發現胃癌CAFs細胞形態多樣，大小形狀不一，呈梭形或星形，細胞表面可見不規則突起，排列不規則并呈重疊生長；胃NFs細胞均勻一致，呈長梭形，排列規整CAFs細胞形態的多樣性可能與其起源有關。目前關于腫瘤內CAFs的起源說法不一，有研究[13]認為CAFs來自中胚層前體細胞，CAFs由纖維細胞、內皮細胞、骨髓間充質細胞及平滑肌細胞分化而成[14]。正常情況下，成纖維細胞在人體胃黏膜組織內處于靜息狀態，即為NFs，胃黏膜受損傷時(如胃潰瘍等)，成纖維細胞被激活并增生，而當腫瘤發生后，遠距離的骨髓間充質細胞被激活為CAFs，并聚集在腫瘤周圍[15]。還有學者[14]發現內皮細胞及平滑肌細胞均可被活化,轉化為CAFs，這些起源細胞均屬于間質細胞。為進一步鑒定CAFs及NFs均起源于間葉組織，而非上皮來源，本研究用抗Vimentin和抗CK18對CAFs及NFs進行免疫細胞化學染色，Vimentin主要存在于間質細胞中，廣泛表達于間葉組織來源的細胞；CK18是分布于上皮細胞的中間絲蛋白，是顯示上皮分化的有用指標。結果顯示CAFs及NFs均表達Vimentin，不表達CK18，說明培養的細胞為間質細胞，不是上皮細胞。有研究發現活化的CAFs在胰腺癌中α-SMA呈陽性表達，并且胰腺癌CAFs主要由胰腺組織內星形細胞活化而來[16]。本研究結果顯示α-SMA在胃CAFs細胞中呈陽性表達，胃NFs細胞中呈陰性表達，α-SMA是鑒別CAFs細胞和NFs細胞的重要標記物，此蛋白具有調節肌成纖維細胞收縮的功能，這一結果說明CAFs細胞可能比NFs細胞伸縮性強，并且Erdogan等[17]在膠原凝膠收縮實驗中發現CAFs細胞的伸縮性高于NFs細胞。Chen等[18]發現過表達α-SMA的CAFs與鼻咽癌的預后差有關，α-SMA在胃CAFs細胞促進胃癌發展中的作用機制目前還不清楚，這有待于進一步研究。

在食管癌、宮頸癌、乳腺癌CAFs與NFs細胞生物學特征比較的研究[19]中，均發現CAFs細胞增殖速度明顯高于NFs細胞，為了解胃CAFs與胃NFs之間細胞增殖速度是否存在差異，本研究采用MTT法檢測胃CAFs與胃NFs細胞增殖情況，并繪制細胞生長曲線，發現胃CAFs細胞生長速度顯著高于胃NFs細胞。這說明異常增殖是胃CAFs的生物學行為特征之一，因此胃CAFs可作為胃癌治療的新的靶標。在乳腺癌CAFs的相關研究中發現，乳腺癌CAFs的異常增殖歸因于氧化應激，而共濟失調性毛細血管擴張癥突變蛋白(ATM)作為重要的氧化還原傳感器，氧化性ATM在CAFs異常增殖中起著重要作用，它可以參與DNA損傷應答及細胞穩態的調節[20]。而胃CAFs異常增殖的機制還需進一步深入研究。

綜上所述， 成功分離胃CAFs、胃NFs。胃CAFs生長速度快，胃CAFs、胃NFs均存在Vimentin表達。胃CAFs細胞特異性表達α-SMA。胃CAFs增殖能力優于胃NFs。