rCBFmax值對膠質瘤術前分級的價值及與MVD表達間關系的初步研究

吳靜，汪文勝，顏劉清，陳楷哲，林翰波，成麗娜，賀鵬，梁倩雯

作者單位：廣東三九腦科醫院影像中心，廣州510510

根據世界衛生組織(World Health Organization，WHO)2016最新版中樞神經系統腫瘤的病理分類[1]，腦膠質瘤(brain glioma，BG)分為低級別膠質瘤(Ⅰ、Ⅱ級)、高級別膠質瘤(Ⅲ、Ⅳ級)。臨床上，高、低級別膠質瘤的治療方式及預后不同，前者術后常規輔以放化療，而后者大部分只需手術切除即可[2]。因此，術前對膠質瘤級別的判斷對臨床治療有重要指導意義。微血管密度(microvessel density，MVD)與腫瘤侵襲性及預后密切相關，有研究認為MVD與膠質瘤級別相關[3-4]，目前主要依賴術后病理檢測。動脈自旋標記(arterial spin labeling，ASL)技術可半定量測定腫瘤內部血流灌注情況，從而間接預測腫瘤微血管生成情況[5-6]。本研究擬通過測定平均最大相對腦血流量(mean maximum relative cerebral blood flow，rCBFmax)值與腫瘤MVD之間的相關性，并與病理結果對照，來評價ASL術前對膠質瘤分級及無創性預測患者預后的能力。

1 材料與方法

1.1 一般資料

收集我院2015年1月至2016年12月50例膠質瘤患者的資料，術前均行ASL檢查，男性29例，女性21例，年齡6～72歲，平均37.2歲。根據2016年WHO 中樞神經系統腫瘤的病理分類[1]，包括低級別膠質瘤(Ⅰ、Ⅱ級)30例、高級別膠質瘤(Ⅲ、Ⅳ級)20例。所有患者術前均未進行放化療等抗腫瘤治療，并在MR檢查后1 w內手術。手術切除腫瘤組織均行MVD免疫組化表達測定。

1.2 ASL檢查

1.2.1 儀器設備

所有患者磁共振檢查均符合安全原則，并簽有知情同意書。采用GE Signa HDxt 3.0 T MRI掃描，8通道相控陣頭線圈。

1.2.2 主要成像序列與參數

3D-T1WI BRAVO序列：TR=8.8 ms，TE=3.5 ms，FA=15 度，層厚=1.2 mm，激勵次數=1，FOV=240 mm×240 mm，矩陣=256×256。3D-ASL 序列：TR=4599 ms，TE=9.8 ms，層厚=4 mm，激勵次數=3，FOV=240 mm×240 mm，矩陣=512×512，標記后延遲時間=1525 ms。

1.2.3 3D-ASL圖像后處理

將原始數據導入GE工作站(ADW4.6)，采用Functool 軟件對圖像進行后處理。

1.2.4 感興趣區選擇

由兩位經驗豐富的神經影像醫師共同討論，參考相關文獻[7]，避開囊變、出血、壞死及鈣化區，選用熱點法放置感興趣區于腫瘤實性部分并測量3次取平均值，計算方法如下：腫瘤最大相對灌注量=腫瘤最大灌注區平均值/對側大腦半球灰質平均值×100%。

1.3 MVD表達的免疫組化檢測與結果判定

1.3.1 檢測方法

采用免疫組化鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連接(S-P)法檢測膠質瘤組織中MVD表達，其中MVD用CD31來標記。

1.3.2 主要試劑

小鼠抗人CD31單克隆抗體、S-P超敏試劑盒及DAB試劑盒均購自中杉生物技術公司。

1.3.3 結果判定

由兩位神經病理科醫師進行分析，膠質瘤分為Ⅰ～Ⅳ級，其中Ⅰ、Ⅱ級為低級別膠質瘤，Ⅲ、Ⅳ級為高級別膠質瘤。MVD的計數采用Weidner法[8]，將切片置于40倍顯微鏡下確定最高血管密度區域，即熱點區，再于400倍視野下計數，選擇5個最高血管密度區進行微血管計數，然后求其平均值作為該病例的MVD值。

1.4 統計學處理

用SPSS 17.0統計分析軟件包處理數據，對數據進行正態檢驗和方差齊性檢驗，兩樣本均數比較采用Mann-Whitney檢驗，兩變量的相關分析采用Spearman相關性檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 腫瘤rCBFmax值與膠質瘤級別

隨著膠質瘤級別增高，腫瘤平均rCBFmax值升高。本研究中低級別膠質瘤組平均rCBFmax值(1.69±1.27)低于高級別膠質瘤組(3.18±1.46)，兩組間差異有統計學意義(P＜0.01)。腫瘤rCBFmax值與膠質瘤級別呈正相關(r=0.620，P＜0.01)，見圖1、2，表1。

2.2 MVD值與膠質瘤級別

表1 不同級別膠質瘤rCBFmax值與MVD表達關系Tab.1 The rCBFmax and MVD differences of astrocytoma

隨著膠質瘤級別增高，腫瘤平均MVD值升高。本研究中低級別膠質瘤平均MVD值(25.43±13.03)明顯低于高級別膠質瘤組(58.69±20.39)，兩組間差異有統計學意義(P＜0.01)，且與級別呈正相關(r=0.698，P＜0.01)，見圖1、2，表1。

圖1 男，72歲，右側顳葉膠質母細胞瘤(WHO Ⅳ級)。A ：T1WI增強圖，右側顳葉腫瘤(箭)；B：3D-ASL CBF圖，腫瘤實性部分rCBFmax值為3.17；C：MVD免疫組化染色圖，平均MVD值為101.4 圖2 女，38歲，右側額葉彌漫性星形細胞瘤(WHO Ⅱ級)。A ：T1WI增強圖，右側額葉腫瘤(箭)，增強后未見明顯強化；B：3D-ASL CBF圖，腫瘤實性部分rCBFmax值為1.89；C：MVD免疫組化染色圖，平均MVD值為12.3Fig. 1 Seventy-two years old man, a histologically verified grade Ⅳ glioblastoma in the right temporal lobe. A: T1WI enhanced Fi, right temporal lobe tumor (arrow); B: 3D-ASL CBF Fi, the rCBFmax value of the solid part of the tumor was 3.17; C: Immunohistochemical staining of MVD Fi, the average MVD value was 101.4. Fig. 2 Thirty-eight years old woman, a histologically verified grade Ⅱ diffuse astrocytoma in the right frontal lobe. A: T1WI enhanced Fi, right frontal lobe tumor (arrow), there was no obvious enhancement after enhancement; B: 3D-ASL CBF Fi, the rCBFmax value of the solid part of the tumor was 1.89; C: Immunohistochemical staining of MVD Fi, the average MVD value was 12.3.

圖3 膠質瘤rCBFmax值與MVD表達相關性的線性回歸圖Fig. 3 Linear regression diagram correlation between rCBFmax value and MVD of gliomas.

2.3 腫瘤rCBFmax值與MVD相關性

腫瘤rCBFmax值與MVD值呈正相關(r=0.723，P＜0.01)，見圖3。

3 討論

3.1 rCBFmax值與膠質瘤級別的關系

ASL技術是一項新興的磁共振功能檢查技術，具有無輻射、無創、可重復性、無需注射對比劑等優點，尤其適合用于老人、小孩及腎功能不全的患者[2，9]，多項研究證實其可取代傳統的動態磁敏感對比增強法對膠質瘤內部微血管灌注進行評價[10-12]。眾所周知，腫瘤的生長與微血管生成密切相關，腫瘤的微血管密集程度是惡性腫瘤分級的最重要標準之一。病理學是評價微血管密度的金標準，但是屬于有創性檢測。常規MR增強反映的是血腦屏障的破壞，不能準確顯示腫瘤內部微血管豐富或密集程度，觀察到的腫瘤強化部分也不能代表腫瘤惡性程度最高的部分，從而對膠質瘤術前分級存在誤判。而ASL技術的主要參數rCBFmax值顯示的是腫瘤微血管灌注情況，從而間接反映腫瘤微血管密集程度，對術前無創性預測膠質瘤級別準確性較高；并且由于膠質瘤的異質性，腫瘤內部微血管灌注往往不均勻，同一膠質瘤不同部位取材可能最后病理結果并不一致，筆者采用熱點法[7]所測rCBFmax值是腫瘤內部微血管最為密集之處，理論上對應膠質瘤內部惡性程度最高部分，從而更準確預測膠質瘤分級。本研究筆者選用相對灌注量而非絕對灌注量，是因為從理論上來說，雖然絕對灌注量可通過ASL方法測定，但是實際應用中有很多不穩定因素影響測值，比如組織和血液的弛豫時間不同及病理狀態等。因此通過使用ASL測量的CBF值被認為是成比例，而不是等同于實際局部CBF值，所以用相對血流量來表述更為恰當。需要指出的是，之所以選擇腫瘤最大灌注值，是由膠質瘤內部異質性與不均質性決定的，此處對應血管最為密集，相對病理學分級最高，此與病理學測定方法也是一致的。曲源等[13]研究表明高級別膠質瘤的CBF值顯著高于低級別膠質瘤；董衛敏等[2]研究表明高低級別膠質瘤組最大腦血流量、對側正常灰質腦血流量的平均值分別為2.13±1.14、0.79±0.40，差異有統計學意義；李銳等[14]研究表明高低級別膠質瘤組rCBFmax-ASL值分別為2.57±0.16、1.16±0.05，兩組間差異有統計學意義；張玉琴等[15]研究結果為高低級別膠質瘤CBF值患側/健側比值分別為3.11±1.45、0.86±0.28，兩組間差異有統計學意義。本研究中低級別膠質瘤組平均rCBFmax值(1.69±1.27)明顯低于高級別膠質瘤組(3.18±1.46)，兩組間差異有統計學意義，腫瘤rCBFmax值與膠質瘤級別呈正相關，說明腫瘤平均rCBFmax值可用于膠質瘤內部微血管灌注情況的評價，進而反映膠質瘤級別，并且隨著膠質瘤級別升高而數值有增高趨勢，此與上述文獻報道一致[2，13-15]。

3.2 MVD值與膠質瘤級別關系

CD31是一種跨膜糖蛋白[3]，屬于免疫球蛋白超級家族成員，主要分布在脈管細胞如單核細胞、中性粒細胞細胞表面，尤其在培養的血管內皮細胞的連接處有高水平表達，與血管形成關系密切，因此可作為內皮細胞特異的標記物。病理上即可使用CD31標記的血管內皮細胞來計算MVD，從而評價膠質瘤級別。張旭標等[4]對44例腦膠質瘤標本采用免疫組化染色法與雙重免疫熒光組化染色法對血管內皮細胞標記物CD31表達進行檢測，結果顯示，Ⅲ級、Ⅳ級膠質瘤組織中CD31陽性表達率明顯高于Ⅱ級病變組織。王建禎等[3]用Northern雜交和免疫組化法檢測50例膠質瘤，結果顯示低級別膠質瘤和正常腦組織中陽性血管數量明顯少于高級別膠質瘤組，CD31在膠質瘤中的表達水平隨著膠質瘤級別的增加而增加。本研究中低級別膠質瘤平均MVD值(25.43±13.03)明顯低于高級別膠質瘤組(58.69±20.39)，兩組間差異有統計學意義，且與級別呈正相關 。此與文獻報道一致[3-4]。

3.3 rCBFmax值與MVD值表達間關系

本組病例結果顯示腫瘤rCBFmax值與MVD值呈正相關，說明rCBFmax值反映的是微血管灌注情況，能更直觀反映腫瘤內部微血管的形成情況，預測腫瘤微血管密度，為腫瘤術前分級提供參考。國內外已有文獻研究ASL相關參數rCBFmax值與腦腫瘤微血管密度之間的關系[7，16]，結果證實rCBFmax值可預測腫瘤微血管密度，可用于膠質瘤的術前分級(低級別與高級別)，此與本研究結果一致。

3.4 不足之處

本研究的不足之處在于ASL技術圖像空間分辨率較低，采集時間較長，缺乏圖像上rCBFmax值測值點與病理標本的點對點對照分析，并且樣本量仍偏少，未按照各級別膠質瘤來細分，有待加大樣本量并以rCBFmax值來指導病理取材并進一步研究。