酪蛋白酸鈉美拉德反應產物的制備及其乳化特性

王 博，張書文，劉 鷺，逄曉陽，蘆 晶，呂加平,*，于景華*

美拉德反應歷程復雜，反應產物眾多，部分反應機理尚不明確，首先是羰基與氨基縮合生成不穩定的席夫堿，隨后進一步環化，在不同反應條件下，經過阿姆德瑞或海因斯分子重排、斯特勒克降解、縮合和聚合等反應，產生褐黑色的類黑精物質，從而完成整個美拉德反應[1-3]。因此，通過控制美拉德反應的條件和時間，可得到不同階段的美拉德反應產物（Maillard reaction products，MRPs）。國內外學者利用干法或濕法在不同的反應條件下制備MRPs，并對其功能特性進行研究，Li Yue等[4]利用大米蛋白水解物與葡聚糖制備出的MRPs對大米蛋白的溶解性和乳化性有顯著的改善。Qu Bai等[5]在制備含碳酸鈣微粒的脂肪模擬物時，發現酪蛋白酸鈉（sodium caseinate，NaCN）與麥芽糊精共聚物的乳化性明顯優于單獨的NaCN，在增加了食品風味和鈣含量的同時提高了體系穩定性。Bi Binwei等[6]利用干法得到β-乳球蛋白與阿拉伯膠的MRPs，用其作為乳化劑制備的乳狀液在低pH值和高鹽離子濃度條件下具有較好的穩定性。杜玲玲等[7]研究發現乳清蛋白及其水解物與半乳糖的MRPs具有顯著的抗氧化效果。Vhangani等[8]研究表明賴氨酸與果糖的MRPs還原力隨反應時間的延長顯著增大。Corzo-Martínez等[9]研究發現美拉德反應后期產生的蛋白質聚集現象對β-乳球蛋白的表位有掩蔽效應，使其抗原性下降。

美拉德反應制備的蛋白-多糖共價復合物與單一的蛋白相比具有更高的溶解度和乳化性，降低了蛋白質過敏反應，同時它具有抗氧化性，可作為雙功能添加劑應用到食品功能因子輸送體系中。根據前人的研究成果，在實驗室小試的條件下制備MRPs所需的加熱時間較長，時間成本較高，不利于工業化生產，同時所用的部分糖基配體并不符合食品安全國家標準，不能添加到嬰幼兒食品中[10-11]。本實驗在嚴格遵守現行食品安全國家標準的前提下選取材料，利用小型超高溫（ultra high temperature，UHT）設備進行小試的放大實驗，避免水浴、油浴等實驗方法弊端、提高生產效率的同時獲得了工業生產所需的實驗數據，加速和推進實驗室成果走向工業化生產。

本實驗利用小型UHT設備，通過高溫短時制備NaCN與葡萄糖、乳糖、低聚半乳糖、聚葡萄糖的MRPs（以下簡稱為NaCN-g、NaCN-L、NaCN-G、NaCN-P），并結合UV-Vis、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE）等分析技術，測定不同熱處理時間MRPs的褐變指數及色差值反映美拉德反應進程，測定蛋白質分子質量及自由氨基的變化反映蛋白質的交聯程度，以單獨的NaCN為對照，比較不同MRPs的乳化特性及其制備的DHA藻油乳狀液的穩定性。旨在對比不同分子質量的糖與NaCN的反應速率，闡明不同反應程度MRPs的褐變指數及接枝度與乳化活性的關系，篩選出最佳的糖基配體制備新型天然乳化劑，為其在嬰幼兒食品中的應用提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

NaCN（純度≥97%），D-（＋）-葡萄糖（分子質量180 Da）、乳糖（分子質量342 Da）、三硝基苯磺酸（2,4,6-trinitrobenzenesulfonicacidsol，TNBS）（分析純）美國Sigma公司；Life’sTMDHA S35-O300藻油荷蘭皇家帝斯曼集團；低聚半乳糖（分子質量約500 Da）、聚葡萄糖（分子質量約1 300 Da）（均為分析純）上海源葉生物科技有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

T25 Digital高速剪切儀 德國IKA公司；AH100D高壓均質機 ATS工業系統有限公司；EPS301電泳儀美國GE Healthcare公司；FluorChemFC2凝膠成像系統美國Alpha公司；TS-1脫色搖床 其林貝兒儀器有限公司；SPAKK酶標儀 瑞士Tecan公司；Turbiscan AGS穩定性分析儀 法國Formulation公司；Color Quest XE色差儀 美國Hunter Lab公司；小型UHT殺菌設備北京博華精遠科技開發有限公司。

1.3 方法

1.3.1 MRPs的制備

配制質量分數為5%的NaCN溶液，充分水合后按蛋白質與糖質量比1∶1分別向其加入葡萄糖、乳糖、低聚半乳糖、聚葡萄糖，用0.2 mol/L NaOH溶液調節起始pH值為8.0；利用小型UHT殺菌機在130 ℃條件下分別熱處理5、10、15、20、30 s，分別得到NaCN-g、NaCN-L、NaCN-G、NaCN-P，-20 ℃冷凍備用。

1.3.2 乳狀液的制備

將得到的MRPs溶液作為水相，向其緩慢加入質量分數10%的DHA藻油（油相），在中等剪切速率條件下剪切3 min得初乳狀液，然后經高壓均質機在（65±5） MPa條件下均質3 次得到最終的乳狀液，4 ℃冷藏備用[12]。

1.3.3 美拉德反應進程

1.3.3.1 褐變指數的測定

參照Zhang Bo等[13]的方法略作改動，將待測樣品用0.1% SDS溶液稀釋至總固形物質量濃度為5 mg/mL，以0.1% SDS為空白，測定420 nm波長處的吸光度，即產物的褐變指數。

1.3.3.2 L*、a*、b*值的測定

采用Color Quest XE色差儀分別測量每個樣品溶液L*、a*、b*值[14]，其中L*代表樣品的亮度；a*和b*代表顏色（色調），其中-a*為綠色，a*為紅色，-b*為藍色，b*為黃色，測定時取10 mL溶液于標準比色皿中，每個樣品平行測定3 次。

1.3.3.3 SDS-PAGE測定

參照Laemmli[15]的方法進行SDS-PAGE分析，在凝膠板中先后加入約5 mL 12%的分離膠和2 mL 5%的濃縮膠，室溫條件下待其凝固。將樣品稀釋至蛋白質量濃度為1 mg/mL，90 ℃熱處理10 min，上樣量為10 μL，使用分子質量標準品（11～245 kDa）評估樣品的分子質量大小。用EPS301電泳儀進行實驗，起始電壓為80 V，當樣品進入分離膠與濃縮膠交界處時，將電壓調到120 V，約1.5 h后樣品到達距底凝膠板低端1 cm處，關閉電泳儀，用考馬斯亮藍R-250染色液進行染色2 h，再經脫色液脫色1 h，直至條帶清晰可見。

1.3.3.4 接枝度的測定

采用TNBS法對MRPs的接枝度進行測定，參照Adler-Nissen[16]的方法略作改動。將待測樣品稀釋到合適的濃度后，取50 μL稀釋液于離心管中，向其加入400 μL 0.2 mol/L pH 8.2的磷酸鹽緩沖溶液，混勻后加入200 μL 0.1% TNBS溶液（TNBS溶液避光保存且現用現配），離心管于50 ℃水浴中加熱60 min（加熱過程中離心管應包上鋁箔避光），然后加入800 μL 0.1 mol/L的HCl溶液，快速振蕩終止反應，最后將樣品靜置于室溫條件下冷卻30 min，在340 nm波長處測定吸光度At，以50 μL蒸餾水替代MRPs樣品作為空白，以未經處理的蛋白與糖的混合物為標準，在340 nm波長處測定吸光度A0，按公式（1）計算接枝度：

1.3.4 MRPs乳化特性

1.3.4.1 乳化活性和乳化穩定性的測定

參照Pearce等[17]的方法略作改動。取20 mL制備好的MRPs溶液于50 mL燒杯中，加入質量分數2%的DHA藻油，在中等剪切速率條件下剪切1 min，分別于0 min和10 min時從燒杯底部吸取50 μL乳濁液，用0.1% SDS溶液定容至5 mL，旋渦后于500 nm波長處測定吸光度，以0.1% SDS溶液為空白。用0 min的吸光度A0表示乳化活性，乳化穩定性按公式（2）計算：

式中：A10為將乳狀液靜置10 min后所測得的吸光度；10為2 次測定的時間間隔，即10 min。

1.3.4.2 乳狀液穩定性快速評價

利用Turbiscan AGS穩定性分析儀對乳狀液的穩定性進行快速分析[18]。儀器采用近紅外作為光源，與透射光檢測器和背散射光檢測器組成測量探頭，對樣品池從底部到頂部每40 μm掃描一次，在一定時間內連續掃描，獲得透射光與背散射光信號對樣品高度的函數曲線圖，即可反映出樣品中顆粒的運動趨勢，或根據背散射光計算出樣品穩定性指數（turbiscan stability index，TSI），進而預測出乳狀液的穩定性。本實驗選用TSI分析乳狀液的穩定性，取1.3.2節中制備的乳狀液20 mL于樣品瓶中，將樣品瓶放入檢測池中，溫度設定為25 ℃，每1 h掃描一次，掃描24 h，記錄掃描圖譜。實驗重復測定3 次。

1.4 數據統計分析

采用SSPS 20.0軟件對數據進行處理，結果以 ±s表示。采用單因素方差分析組間差異性，以P值小于0.05表示差異顯著，使用軟件Origin 8.0繪圖。

2 結果與分析

2.1 NaCN與不同糖美拉德反應的褐變指數測定結果

圖1 糖的種類對美拉德反應的褐變指數的影響Fig. 1 Effect of sugar type on browning index of Maillard reaction

美拉德反應屬于非酶褐變反應，A420nm是監測反應褐變指數的特征吸收值[19]。美拉德反應程度與褐變指數呈正相關，隨著美拉德反應時間的延長，溶液顏色變深，吸光度變大，說明美拉德反應程度加深，進行到反應后期生成類黑精，溶液褐變指數達到最大。由圖1可知，隨熱處理時間的延長，各組溶液的褐變指數逐漸增大，糖的種類不同，褐變程度不同。NaCN-g和NaCN-G在熱處理初始時褐變指數明顯增大，而NaCN-L和NaCN-P在熱處理15 s后褐變指數才明顯增大，且小于NaCN-g和NaCN-G；熱處理30 s后，NaCN-g、NaCN-L、NaCN-G和NaCN-P的褐變指數分別達到0.148、0.110、0.133和0.111。除乳糖外，溶液的褐變指數隨糖分子質量的增加而減小，說明小分子質量的糖更易于發生美拉德反應，與Li Yue等[20]報道的一致。乳糖雖為二糖，但反應速率較慢，這可能與它的結構有關，乳糖由葡萄糖的第4個碳原子和半乳糖的第1個碳原子以β-1,4糖苷鍵縮合反應脫去一份子水得到，保留的還原性葡萄糖醛基與第5個碳原子的醇基縮合成半縮醛式吡喃環結構，說明乳糖醛基存在并不明顯[21]，還原性較弱，所以反應速率較慢。

2.2 NaCN與不同糖美拉德反應的L*、a*、b*值測定結果

表1 不同熱處理時間條件下MRPs的L*、a*、b*值Table 1 L*, a*, and b* values of MRPs at different heat treatment times

隨著美拉德反應的進行，大量深色物質生成使溶液顏色變深，從而引起L*、a*和b*值的變化。每組以未經熱處理溶液的L*、a*、b*值為參比，由表1可知，隨熱處理時間的延長，各組的L*、a*、b*值的變化均顯著（P＜0.05），并且趨勢相同，L*值逐漸減小，溶液變暗，a*值和b*值逐漸增大，溶液變紅變黃，與Martinez-Alvarenga等[22]報道的一致。說明隨著熱處理時間的延長，美拉德反應程度加深，生成的深色物質不斷積累，NaCN-g、NaCN-L、NaCN-G和NaCN-P各組的總色差ΔE分別為43.90、20.72、36.42和25.23，其中NaCN-g的總色差ΔE最大，顯著高于其他組（P＜0.05），說明NaCN-g顏色變化更顯著，葡萄糖更易于發生美拉德反應，這與褐變指數的變化趨勢相同。

2.3 SDS-PAGE分析結果

圖2 NaCN-g（A）、NaCN-L（B）、NaCN-G（C）、NaCN-P（D）的SDS-PAGE圖Fig. 2 Electrophoresis patterns of MRPs from NaCN-g (A),NaCN-L (B), NaCN-G (C), and NaCN-P (D) with sodium caseinate

在美拉德反應過程中，蛋白質肽鏈中的氨基酸殘基和還原糖發生交聯，生成大分子物質，使蛋白質分子質量增加[23-24]。由圖2可知，加熱之后各組在分離膠上端高分子質量區域出現條帶，說明4 種糖與NaCN均發生了美拉德反應，生成了大分子聚合物；在相同的熱處理條件下，NaCN-g生成的高分子聚合物條帶顏色最深，如圖2方框所示，同時酪蛋白條帶顏色變淺，說明較多的蛋白質參與反應，遷移到高分子區域，NaCN-g的美拉德反應程度更大，與2.1節和2.2節的結果一致。

2.4 NaCN與不同糖美拉德反應的接枝度測定結果

圖3 不同反應時間MRPs的接枝度Fig. 3 Graft degree of MRPs with different reaction times

參與美拉德反應的游離氨基主要來自賴氨酸側鏈上的或蛋白質分子肽鏈N-末端上的自由氨基，游離氨基的減少表現為接枝度的上升[25]。隨著熱處理時間的延長，蛋白質分子部分伸展使內部的ε-氨基逐漸暴露在分子表面，羰基與氨基結合，各組接枝度逐漸升高，如圖3所示，NaCN-g、NaCN-L、NaCN-G和NaCN-P在熱處理20、10、30 s和30 s時接枝度達到最大，分別為14.03%、6.89%、11.45%和6.56%，其中NaCN-g的接枝度最大，進一步證明葡萄糖更易接枝到蛋白分子上；隨著反應的進行，堿性氨基酸賴氨酸不斷消耗，同時MRPs降解產生乙酸等物質使溶液的pH值下降，不利于羰基與氨基結合，但美拉德反應還在繼續，蛋白質的相互作用增加，發生糖降解、加成聚合、異構化等反應，導致各組的接枝度下降。對于聚葡萄糖等大分子多糖，糖基分子質量越大，反應物中還原性羰基的濃度越低，空間位阻越大[26]，較難與蛋白質分子鏈上的氨基結合，所以熱處理30 s后才出現接枝度的明顯升高。

2.5 不同MRPs的乳化活性和乳化穩定性

乳化活性是指其能夠參與形成乳狀液的能力，乳化穩定性是指其保持所形成的乳狀液穩定的能力，使乳狀液在一定的時間內不會發生乳液分層絮凝等[17]。由圖4A可知，隨熱處理時間的延長，包括對單獨的NaCN進行熱處理的對照組在內，所有組的乳化活性呈現先上升后下降的趨勢，對照組的乳化活性從0.34升高到0.46，是因為熱處理使蛋白質結構伸展，內部疏水基團暴露，油-水界面張力降低，從而提高NaCN乳化活性[27]，但過度的熱處理破壞了蛋白質的結構，蛋白質的相互作用增加，導致凝聚和沉淀，使乳化活性下降。

圖4 不同反應時間MRPs的乳化活性（A）和乳化穩定性（B）Fig. 4 Emulsifying activity (A) and emulsion stability (B) of MRPs with different reaction times

實驗組中，NaCN與不同種類的糖通過美拉德反應得到的MRPs的乳化活性均有不同程度的改善，糖的種類不同，MRPs的乳化活性不同，NaCN-g、NaCN-L、NaCN-G和NaCN-P的乳化活性達到的最大值分別為0.63、0.51、0.55和0.48，其中130 ℃熱處理15 s得到的NaCN-g的乳化活性最大，約為同等條件下NaCN的2 倍，與水浴90 ℃熱處理90 min相當，極大縮短了熱處理的時間，并且其乳化穩定性也呈現較高的水平，為123.88 min（圖4B）；但繼續熱處理，NaCN-g的接枝度雖然增大，但乳化活性反而下降，可能是因為結合在蛋白質上的糖分子數過多，NaCN-g過度親水使其在油-水界面的吸附能力下降，以及發生環化和降解等反應導致MRPs分子質量的差別逐漸增大，分子質量的兩極分化會對蛋白質的乳化能力造成不良影響[28]，從而對產物的乳化能力造成不利的影響。所以為得到較高乳化活性的MRPs，應根據所選擇的糖基配體，實際情況對MRPs功能性質的要求，控制美拉德反應程度，達到適宜的接枝度，從而達到改善乳化特性等功能性質的目的。

2.6 乳狀液穩定性分析

圖5 不同乳狀液的TSIFig. 5 Turbiscan stability index of different emulsions

乳狀液是一個熱力學不穩定體系，會發生絮凝、聚結、乳析、沉降等[29-30]。Turbiscan AGS穩定性分析儀得到的TSI反映的是樣品在整個檢測時間濃度和顆粒粒徑的變化幅度的綜合，變化幅度越大，TSI就越大，系統就越不穩定。利用上一步篩選出的各組乳化活性最高的MRPs制備DHA藻油乳狀液，對其穩定性進行測試，DHA藻油乳狀液不穩定性常表現為底部澄清和頂部脂肪上浮，得到的TSI結果見圖5，各組乳狀液的TSI分別為2.4、1.5、2.1、1.9和2.0，NaCN-g、NaCN-L、NaCN-G和NaCN-P作為乳化劑制備的乳狀液TSI均小于對照組NaCN，由此可知，美拉德反應的確使NaCN的乳化性質得到改善，并且NaCN-g的TSI顯著小于其他各組（P＜0.05），說明NaCN-g制備的DHA藻油乳狀液更穩定，所以葡萄糖可作為良好的糖基配體，通過美拉德反應顯著改善NaCN的乳化特性，與2.5節的結果相一致。

3 結 論

美拉德反應機理復雜，影響因素眾多，其中溫度、pH值和底物對美拉德反應的影響較為顯著。反應溫度相差10 ℃，褐變速率相差3～5 倍；當溶液的pH值大于3時，反應速率隨pH值升高而加快。但反應溫度、pH值過高，反應速率則難以控制，導致蛋白質、糖或中間產物降解成小分子物質，降低產物的乳化能力；另外，在嬰幼兒配方奶粉等食品的實際生產過程中，應盡量使體系的pH值保持在中性范圍，否則會影響產品中其他蛋白的穩定性，所以本實驗選擇反應溫度130 ℃，起始pH值8.0，反應結束后測得溶液的pH值在7.6左右，較為合理。

美拉德反應可以顯著改變NaCN的乳化特性。實驗表明，小分子質量的糖更易于發生美拉德反應，乳糖雖為小分子質量糖，但因其醛基存在并不明顯，還原性較弱，反應速率較慢；褐變指數與反應程度呈正比，MRPs的接枝度與乳化性質的變化并不成線性關系；葡萄糖可以作為一種優良的糖基配體通過美拉德反應顯著改善NaCN的乳化特性，利用小型UHT設備在130 ℃條件下對總固形物含量為10%的蛋白-糖（1∶1，m/m）混合液熱處理15 s得到的MRPs的乳化特性較好，與水浴90 ℃加熱90 min的效果相當；反應后可作為新型乳化劑對DHA藻油等易氧化敏感物質進行包埋并添加到嬰幼配方奶粉等食品中，此方法可實現連續化、高效率制備蛋白乳化劑，極大縮短了熱處理時間，對工業化生產具有指導意義。