具有α-葡萄糖苷酶抑制作用益生菌的篩選及特性分析

王 芬，劉 鷺，李函彤，張書(shū)文，蘆 晶，逄曉陽(yáng)，汪建明,*，呂加平,*

糖尿病是一種由于胰島素分泌不足（I型）或胰島素抵抗（II型）引起的一種內(nèi)分泌代謝紊亂性疾病，其特點(diǎn)是慢性高血糖癥[1]。目前糖尿病已成為一種主要的慢性疾病，對(duì)人類(lèi)的生活和健康造成了巨大的損害[2]，其中多數(shù)患者為II型糖尿病，主要特征有高血糖、低度炎癥、β細(xì)胞損壞、胰島素抵抗及系列并發(fā)癥[3]。根據(jù)世界衛(wèi)生組織的數(shù)據(jù)顯示，至2017年，中國(guó)糖尿病的患病率已居世界首位，人數(shù)約1.1億，約占中國(guó)成年人總數(shù)的1/10。依照目前發(fā)展趨勢(shì)，到2040年，我國(guó)患者將超過(guò)1.5億。因此，急需通過(guò)有效措施預(yù)防和治療糖尿病。

食物中的碳水化合物在腸道內(nèi)主要以單糖的形式被吸收。人體攝入的淀粉等多糖物質(zhì)被唾液和胰α-淀粉酶降解生成寡糖及二糖后，還需要在腸道黏膜α-葡萄糖苷酶的作用下酶解生成葡萄糖后才能被吸收[4]。因此，α-葡萄糖苷酶已成為抑制碳水化合物吸收、降低血糖藥物開(kāi)發(fā)的有效靶點(diǎn)。目前，已在臨床上應(yīng)用的α-葡萄糖苷酶抑制劑類(lèi)降血糖藥物主要有阿卡波糖、伏格列波糖、米格列醇[5]。α-葡萄糖苷酶抑制劑主要通過(guò)可逆性競(jìng)爭(zhēng)α-葡萄糖苷酶與糖的結(jié)合位點(diǎn)，限制或延緩碳水化合物在腸內(nèi)的分解和吸收，有效推遲并減輕糖尿病人餐后血糖升高的時(shí)間及進(jìn)程，進(jìn)而發(fā)揮降糖作用[6]，因此，α-葡萄糖苷酶抑制劑主要適用于以碳水化合物為主食的人群，特別是中老年糖尿病患者[7]。

目前大量研究表明，一些益生菌的降血糖、抗氧化能力對(duì)人類(lèi)II型糖尿病的治療起到了有益的作用。Lactobacillus rhamnosus CCFM0528可以顯著降低STZ誘導(dǎo)的II型糖尿病小鼠的空腹、餐后血糖、糖基化血紅蛋白、內(nèi)毒素、腫瘤壞死因子、白細(xì)胞介素-6和白細(xì)胞介素-8水平[8]。Ejtahed等[9]發(fā)現(xiàn)嗜酸乳桿菌和雙歧桿菌可以改善II型糖尿病人的空腹血糖。何秋雯[10]報(bào)道益生菌干酪乳桿菌（L. casei Zhang）對(duì)預(yù)防和穩(wěn)定STZ所致的II型糖尿病大鼠的血糖升高、血液及尿液電解質(zhì)紊亂具有一定的改善作用。乳酸菌G15和Q14能夠顯著改善糖尿病大鼠的糖耐量，降低糖基化血紅蛋白，改善II型糖尿病大鼠胰島β細(xì)胞受損及體重減輕的癥狀[11]。Moroti等[12]發(fā)現(xiàn)嗜酸乳桿菌和雙歧桿菌顯著降低糖尿病老年患者血糖水平。Chen Pei等[13]報(bào)道干酪乳桿菌CCFM0412具有較好的α-葡萄糖苷酶酶活的抑制率（29.61%）及較高的抗氧化能力。

2001年，聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織/世界衛(wèi)生組織對(duì)益生菌的定義是“攝入量足夠時(shí)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生有益作用的活性微生物”[14]。Del Piano等[15]認(rèn)為益生菌應(yīng)該是“在一定程度上能耐受胃液，膽汁和胰臟分泌物而黏附于腸道上皮細(xì)胞，并在空腸和回腸大量繁殖的一類(lèi)活的微生物”。因此，菌體細(xì)胞對(duì)胃腸道環(huán)境具有較高的耐受性對(duì)于發(fā)揮益生作用至關(guān)重要[16-17]。本實(shí)驗(yàn)從菌株的細(xì)胞代謝物（cell-free excretory supernatants，CFS）和細(xì)胞內(nèi)容物（cell-free extracts，CFE）對(duì)實(shí)驗(yàn)室保藏的77 株益生菌進(jìn)行了降糖作用的篩選；在此基礎(chǔ)上，充分模擬人體的消化環(huán)境對(duì)篩選的菌株進(jìn)行評(píng)估；最后通過(guò)主成分分析篩選出1 株既具有潛在α-葡萄糖苷酶抑制作用又能很好的在體內(nèi)生存的益生菌。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

77 株益生菌（表1）由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所乳品實(shí)驗(yàn)室保藏。

4-硝基苯基-D-吡喃葡糖苷（4-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside，PNPG）、α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶、黏蛋白II、黏蛋白III、溶菌酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、膽鹽、cFDA-SE染液 美國(guó)Sigma公司；其余試劑均為分析純。

表1 77 株菌株來(lái)源及編號(hào)Table 1 Information about 77 probiotic strains

續(xù)表1

1.2 儀器與設(shè)備

LDZX-50KB立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；SK15離心機(jī) 美國(guó)Sigma公司；JY92-IIN超聲波細(xì)胞破碎機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；SPARK 20M多功能酶標(biāo)儀 瑞士Tecan公司；BD FACSCalibur流式細(xì)胞儀、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 日本Takara公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種的活化及其菌落總數(shù)的測(cè)定

將凍存于-80 ℃的77 株甘油管保藏的益生菌接入MRS肉湯培養(yǎng)基中，于37 ℃恒溫靜置培養(yǎng)18 h，活化3 代后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

將活化好的菌株以體積分?jǐn)?shù)4%的接種量接入MRS肉湯培養(yǎng)基中，于37 ℃靜置培養(yǎng)18 h，收集菌液，根據(jù)GB 4789.2—2010《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》[18]進(jìn)行菌株菌落總數(shù)的測(cè)定，將菌液濃度調(diào)節(jié)為1×109CFU/mL。

1.3.2 樣品的制備

1.3.2.1 CFS的制備[19]

益生菌在MRS培養(yǎng)基中37 ℃靜置培養(yǎng)18 h后，于4 ℃、12 000 r/min離心15 min收集菌體。將收集到的菌體用0.1 mol/L無(wú)菌PBS（pH 6.8）洗滌3 次，再重懸于PBS中，調(diào)節(jié)菌液濃度至1×109CFU/mL，混勻。于37 ℃孵育12 h，于4 ℃、12 000 r/min離心15 min，收集上清液，以0.22 μm水系微濾膜過(guò)濾得到CFS，-80 ℃保存。

1.3.2.2 CFE的制備[18]

益生菌在MRS培養(yǎng)基中37 ℃靜置培養(yǎng)18 h后，于4 ℃、12 000 r/min離心15 min收集菌體。將收集到的菌體用0.1 mol/L無(wú)菌PBS（pH 6.8）洗滌3 次，再重懸于PBS中，調(diào)節(jié)菌液濃度至1×109CFU/mL，混勻，進(jìn)行超聲破碎。超聲破碎條件：在冰浴的條件下，功率200 W，以3～5 s（工作3 s，停5 s）的脈沖破碎12 min。將超聲后得到的液體于4 ℃、12 000 r/min離心15 min，收集上清液，以0.22 μm水系微濾膜過(guò)濾得到CFE，-80 ℃保存。

1.3.3 α-葡萄糖苷酶抑制活性的測(cè)定[20]

取96 孔酶標(biāo)板，用微量移液器在反應(yīng)孔中加入25 μL 20 mmol/L的PNPG及25 μL CFS或CFE，于37 ℃孵育10 min，再加入0.01 U/mL的α-葡萄糖苷酶50 μL，37 ℃反應(yīng)15 min，最后加入100 μL的0.1 mol/L的Na2CO3溶液終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀于405 nm波長(zhǎng)處測(cè)定反應(yīng)液的吸光度。用阿卡波糖作陽(yáng)性對(duì)照，按公式（1）計(jì)算[21]：

式中：A1為含有酶不含樣品的吸光度，樣品用0.1 mol/L的PBS（pH 6.8）代替；A2為不含酶不含樣品的0.1 mol/L的PBS（pH 6.8）吸光度；A3為含有酶含有樣品的吸光度；A4為不含酶含有樣品樣液吸光度，酶用0.1 mol/L的PBS（pH 6.8）代替。

1.3.4 16S rDNA基因測(cè)序

將篩選得到的菌株按體積分?jǐn)?shù)4%（下同）的接種量接入MRS肉湯培養(yǎng)基中，于37 ℃靜置培養(yǎng)18 h。取2 mL菌液按細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取基因組。用瓊脂糖凝膠電泳法和紫外分光光度法檢測(cè)分析DNA的純度及濃度，用細(xì)菌16S rDNA擴(kuò)增通用引物27F（5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’）和1492R（5’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’）進(jìn)行擴(kuò)增[20]。采用瓊脂糖凝膠電泳法對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。最后將擴(kuò)增出的產(chǎn)物由北京華大基因研究中心完成測(cè)序。反應(yīng)體系為DNA模板1 μL；Mix 12.5 μL；上下游引物各1 μL；加ddH2O 9.5 μL至總體積為25 μL。PCR條件為：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性30 s；62 ℃退火30 s；72 ℃延伸30 s，共35 個(gè)循環(huán)；第35個(gè)循環(huán)72 ℃延伸10 min。

1.3.5 益生特性的測(cè)定

1.3.5.1 益生菌耐酸性的測(cè)定

將益生菌以4%的接種量接入MRS肉湯培養(yǎng)基中，于37 ℃靜置培養(yǎng)18 h，在4 ℃、6 000 r/min離心10 min，收集菌體。將收集到的菌體重懸于pH 2.0、3.0、7.0[23]的MRS肉湯培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)菌液濃度至1×109CFU/mL。于37 ℃孵育3 h，收集菌液，根據(jù)GB 4789.2—2010進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。耐受性以存活率計(jì)算，見(jiàn)式（2）[24]：

式中：N1為經(jīng)過(guò)耐受處理?xiàng)l件下的活菌數(shù)/（CFU/mL）；N0為pH 6.4（正常）MRS肉湯培養(yǎng)基中的活菌數(shù)/（CFU/mL）。

1.3.5.2 益生菌耐膽鹽的測(cè)定

將益生菌以4%的接種量接入MRS肉湯培養(yǎng)基中，于37 ℃靜置培養(yǎng)18 h，于4 ℃、6 000 r/min離心10 min，收集菌體。將收集到的菌體重懸于pH 8.0、含2%膽鹽的無(wú)菌去離子水中[22]，調(diào)節(jié)菌液濃度至1×109CFU/mL。于37 ℃孵育24 h，收集菌液，根據(jù)GB 4789.2—2010進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。耐受性的計(jì)算同公式（2）。

1.3.5.3 益生菌在人工模擬唾液、胃液、腸液中生長(zhǎng)的測(cè)定

參考Versantvoort等[25]的方法配制模擬消化液，充分模擬人體口腔，胃腸道中的消化環(huán)境。

將益生菌以4%的接種量接入MRS肉湯培養(yǎng)基中，于37 ℃靜置培養(yǎng)18 h，于4 ℃、6 000 r/min離心10 min，收集菌體。將收集到的菌體分別重懸于人工模擬的唾液（pH 7.0）、胃液（pH 2.0）、腸液（pH 8.0）中，調(diào)節(jié)菌液濃度至1×109CFU/mL。于37 ℃各環(huán)境分別孵育5 min、3 h、24 h，收集菌液，根據(jù)GB 4789.2—2010進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。計(jì)算同公式（2）。

1.3.5.4 益生菌體外模擬的消化實(shí)驗(yàn)[26]

將益生菌以4%的接種量接入MRS肉湯培養(yǎng)基中，于37 ℃靜置培養(yǎng)18 h，于4 ℃、6 000 r/min離心10 min，收集菌體。將收集到的菌體重懸于pH 7.0的模擬唾液中，調(diào)節(jié)菌液濃度至1×109CFU/mL。于37 ℃孵育5 min，4 ℃、6 000 r/min離心10 min，收集菌體；將收集到的菌體繼續(xù)重懸于pH 2.0的模擬胃液中，于37 ℃孵育3 h，4 ℃、6 000 r/min離心10 min，收集菌體；最后再將收集的菌體重懸于pH 8.0的模擬腸液中，于37 ℃孵育24 h，收集菌液，根據(jù)GB 4789.2—2010進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。計(jì)算公式同式（2）。

1.3.5.5 益生菌對(duì)HT-29細(xì)胞黏附性的測(cè)定

cFDA-SE對(duì)益生菌的熒光標(biāo)記[22]：用二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）配制1 mmol/L cFDA-SE的貯備液（稱(chēng)取5.0 mg cFDA-SE溶解于8.969 mL的DMSO試劑中），0.22 μm水系微濾膜過(guò)濾除菌，-20 ℃貯存?zhèn)溆谩⒑Y選得到的益生菌以4%的接種量接入MRS肉湯培養(yǎng)基中，于37 ℃靜置培養(yǎng)18 h，4 ℃、3 000×g離心5 min，棄上清液，收集菌體。將收集到的菌體用無(wú)菌PBS洗3 次，重懸于PBS溶液中，調(diào)節(jié)菌液濃度至1×109CFU/mL。加入cFDA-SE貯液（1 mmol/L）至終濃度為20 μmol/L，于37 ℃避光靜置20 min，4 ℃離心（5 000×g，10 min），棄上清液，收集菌體。再用PBS洗3 次，將菌體重懸于PBS溶液中，于488 nm激發(fā)波長(zhǎng)下進(jìn)行流式細(xì)胞檢測(cè)，分析cFDA-SE的標(biāo)記率。

HT-29細(xì)胞的培養(yǎng)：將HT-29細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇后，按照1∶3的比例進(jìn)行傳代，傳至新的培養(yǎng)瓶中，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)。每1～2 d換液1 次，待細(xì)胞匯合度長(zhǎng)至90%左右，棄去培養(yǎng)液，用PBS洗3 次，加入1 mL 0.25%胰酶，于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中消化2 min，棄去胰酶，加入培養(yǎng)液終止消化，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞數(shù)至1×105個(gè)/mL，進(jìn)行鋪板，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，待培養(yǎng)板中細(xì)胞匯合度長(zhǎng)至90%～100%時(shí)即可進(jìn)行細(xì)菌黏附實(shí)驗(yàn)。

益生菌對(duì)HT-29細(xì)胞的黏附性實(shí)驗(yàn)：將在24 孔板中培養(yǎng)好的HT-29細(xì)胞，用PBS洗3 次，分別加入500 μL的PBS，cFDA-SE標(biāo)記的益生菌菌懸液；對(duì)照組為空白孔＋500 μL cFDA-SE標(biāo)記的益生菌菌懸液。于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育2 h，用無(wú)菌PBS洗3 次。每孔加入350 μL 0.25%胰酶，于CO2培養(yǎng)箱中消化10 min，待細(xì)胞與培養(yǎng)板底部完全脫落，加入150 μL細(xì)胞培養(yǎng)液終止消化，混勻，取出100 μL懸液轉(zhuǎn)入96 孔板中，用錫箔紙包好，測(cè)定其熒光強(qiáng)度。熒光檢測(cè)條件：激發(fā)波長(zhǎng)為485 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為530 nm。黏附率的計(jì)算為式（3）：

式中：A為HT-29細(xì)胞＋cFDA-SE標(biāo)記的細(xì)菌菌懸液吸光度；A0為HT-29細(xì)胞＋PBS的吸光度；A1為cFDA-SE標(biāo)記的細(xì)菌菌懸液吸光度。

1.3.6 主成分分析

篩選出具有高α-葡萄糖苷酶抑制活性的菌株，對(duì)篩選菌株的α-葡萄糖苷酶抑制活性、耐酸性、膽鹽耐受性、細(xì)胞黏附性及模擬胃腸液的耐受性等指標(biāo)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行主成分分析，篩選出可以很好地在胃腸發(fā)揮α-葡萄糖苷酶抑制活性的菌株。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)用 ±s表示，采用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，利用Origin 8.0、Excel進(jìn)行繪圖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 具有α-葡萄糖苷酶抑制活性菌株的篩選結(jié)果

由表2可以看出，篩選的13 株益生菌的CFS均表現(xiàn)出對(duì)α-葡萄糖苷酶的活性有抑制作用，抑制率可以達(dá)到2.53%～15.76%。陽(yáng)性對(duì)照組阿卡波糖的抑制率最高，為26.75%；7 株益生菌的抑制率達(dá)到了10%以上，其中菌株GS-3對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率最高，為15.76%；菌株BLP12、ST-2、1.1881的抑制率略低，分別為15.10%、13.44%、12.12%，該4 種菌株對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性均可以達(dá)到陽(yáng)性對(duì)照組阿卡波糖抑制活性的50%。且77 株益生菌的CFE對(duì)α-葡萄糖苷酶未呈現(xiàn)抑制作用，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)菌株的CFS提取物中含有抑制α-葡萄糖苷酶活性的物質(zhì)，而CFE中不含或含有極少的該類(lèi)抑制物，具體的結(jié)果還需要進(jìn)一步的研究。根據(jù)抑制率結(jié)果，選出菌株GS-3、BLP12、ST-2、1.1881這4 株菌株進(jìn)行體外模擬環(huán)境的耐受性實(shí)驗(yàn)。

表2 益生菌對(duì)α-葡萄糖苷酶酶活的抑制率Table 2 α-Glucosidase inhibitory rates of probiotics

2.2 16S rDNA基因測(cè)序結(jié)果

對(duì)篩選得到的4 株具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的菌株進(jìn)行菌種鑒定，由表3可以看出，該4 株菌分別屬于干酪乳桿菌和植物乳桿菌。

2.3 益生特性的測(cè)定結(jié)果

益生菌類(lèi)制劑在被人或動(dòng)物食用后，只有在大量活菌順利抵達(dá)、黏附并成功定植于回腸和結(jié)腸部位時(shí)，才能對(duì)宿主發(fā)揮益生作用[28]。在這一消化過(guò)程中，口腔中的環(huán)境，胃部的低pH值環(huán)境及胃液中胃蛋白酶等抗菌物質(zhì)就成為阻礙益生菌進(jìn)入腸道的第一道天然屏障。

2.3.1 益生菌的耐酸性

由圖1可知，菌株編號(hào)為ST-2、1.1881、GS-3、BLP12的菌株在pH 3.0的酸性條件下孵育3 h后，均表現(xiàn)出了很高的存活率，分別為96.75%、108.69%、100.50%、96.93%，存活率均大于95%，其中GS-3、1.1881的存活率大于100%。分析有可能是pH 3.0的條件對(duì)GS-3、1.1881的生長(zhǎng)無(wú)影響，甚至適宜這兩株菌的生存，因此孵育期間反而增殖，造成存活率變高。此外，在pH 2.0的條件下，ST-2、GS-3、BLP12存活率很高，達(dá)到了70%。其中菌株ST-2的存活率最高，達(dá)到了75.97%；而菌株1.1881在pH 2.0的條件下存活率很低，僅為6.19%，說(shuō)明其對(duì)酸敏感。總體來(lái)看，這3 株菌在這2 個(gè)pH值下的生存趨勢(shì)是一致的。Matsumoto等[29]研究發(fā)現(xiàn)菌株的耐酸能力大小與菌株的H＋-ATP酶活性有關(guān)。因此，本實(shí)驗(yàn)中的干酪乳桿菌具有較好的耐酸能力，可能與其H＋-ATP酶活性有關(guān)。

圖1 益生菌對(duì)酸性條件的耐受性Fig. 1 Tolerance of probiotics to low pH

2.3.2 益生菌對(duì)膽鹽的耐受性

圖2 益生菌對(duì)膽鹽的耐受性Fig. 2 Tolerance of probiotics to bile salt

由圖2可知，菌株編號(hào)為ST-2、1.1881、GS-3、BLP12的菌株在含2%膽鹽的去離子水中孵育24 h后，生長(zhǎng)狀況不一。其中菌株ST-2的存活率最高，能達(dá)到1.63%，活菌數(shù)能達(dá)到2.86×107CFU/mL，菌株BLP12的存活率略低，為0.70%，且活菌數(shù)為1.96×107CFU/mL，編號(hào)1.1881的菌株存活率最低，活菌數(shù)達(dá)到1×105CFU/mL，說(shuō)明不同菌株對(duì)膽鹽的耐受性不同。

2.3.3 益生菌在模擬唾液中的耐受性

由圖3可知，菌株編號(hào)為ST-2、1.1881、GS-3、BLP12的菌株在模擬唾液中的生長(zhǎng)狀況良好。以pH 7.0的MRS肉湯培養(yǎng)基中的活菌數(shù)為對(duì)照時(shí)，存活率均達(dá)到了94%以上；以pH 6.4的MRS肉湯培養(yǎng)基中的活菌數(shù)為對(duì)照時(shí)，存活率均達(dá)到了97%以上，菌株ST-2和菌株GS-3的存活率超過(guò)了100%；且這4 株菌株均更適宜在pH 7.0生長(zhǎng)，同時(shí)可以看出無(wú)論以哪種條件為對(duì)照，結(jié)果均是菌株GS-3的存活率最高，ST-2次之，且各菌株之間的存活率沒(méi)有顯著差異。

圖3 益生菌在模擬唾液中的耐受性Fig. 3 Tolerance of probiotics to simulated saliva

2.3.4 益生菌在模擬胃液中的耐受性

圖4 益生菌在模擬胃液中的耐受性Fig. 4 Tolerance of probiotics to the simulated gastric juice

由圖4可知，菌株編號(hào)為ST-2、1.1881、GS-3、BLP12的菌株在模擬胃液中生長(zhǎng)情況不一，其中，菌株ST-2、GS-3存活率較高，分別為76.65%，68.81%；菌株1.1881、BLP12的存活率較低，分別為47.32%、52.49%，基本能達(dá)到50%左右。同時(shí)菌株ST-2、GS-3、BLP12在pH 2.0 MRS肉湯培養(yǎng)基中的存活率均大于在模擬胃液中的存活率，其中ST-2、GS-3的存活率在兩種環(huán)境下的差異不大，但菌株BLP12在pH 2.0 MRS肉湯培養(yǎng)基中的存活率明顯高于在模擬胃液中的存活率。與上述3 株菌不同的是，菌株1.1881在pH 2.0 MRS肉湯培養(yǎng)基中的存活率明顯低于在模擬胃液中的存活率。

2.3.5 益生菌在模擬腸液中的耐受性

由圖5可知，菌株編號(hào)為ST-2、1.1881、GS-3、BLP12的菌株在模擬腸液中的生長(zhǎng)狀況良好，其中菌株1.1881、GS-3、BLP12的存活率均大于90%，菌株ST-2的存活率略低，為74.68%，基本達(dá)到了75%。

圖5 益生菌在模擬腸液中的耐受性Fig. 5 Tolerance of probiotics to simulated intestinal juice

2.3.6 益生菌經(jīng)模擬唾液、胃液、腸液消化后的存活率

圖6 益生菌經(jīng)模擬唾液、胃液、腸液消化后的存活率Fig. 6 Tolerance of probiotics to simulated digestive juice

由圖6可知，菌株編號(hào)為ST-2、1.1881、GS-3、BLP12的菌株在經(jīng)過(guò)模擬唾液、胃液、腸液消化后生長(zhǎng)狀況良好，存活率分別為90.13%、88.62%、89.49%、88.27%，基本達(dá)到了90%左右，且各菌株之間差異很小，可以很好地在模擬環(huán)境中生存，至少存活24 h。

2.3.7 益生菌對(duì)HT-29細(xì)胞黏附性結(jié)果

2.3.7.1 cFDA-SE熒光標(biāo)記結(jié)果

表4 cFDA-SE對(duì)益生菌菌體細(xì)胞的標(biāo)記率Table 4 Labeling rate of cFDA-SE on probiotics

由表4可以看出，cFDA-SE對(duì)這4 株菌的標(biāo)記率都很高，標(biāo)記率均大于85%，其中菌株1.1881的標(biāo)記率最高，為89.60%，且菌株1.1881、BLP12與ST-2、GS-3之間的菌體標(biāo)記效果有顯著性差異（P＜0.05），但不同菌體細(xì)胞標(biāo)記率間的差值最大僅為2.8%，差值較小。

2.3.7.2 益生菌對(duì)HT-29細(xì)胞的黏附性

由圖7可知，菌株編號(hào)為ST-2、1.1881、GS-3、BLP12的菌株對(duì)HT-29細(xì)胞的黏附率各不相同。黏附率范圍為1.31%～16.34%，其中菌株ST-2和1.1881的黏附率明顯高于另外2 株菌，分別為16.34%、12.31%，能達(dá)到10%以上；而菌株GS-3（1.31%）、BLP12（1.93%）的黏附率很低，二者均未達(dá)到2.0%，與菌株ST-2和1.1881的黏附性有顯著性差異（P＜0.05）。李清等[30]研究表明菌株對(duì)Caco-2細(xì)胞的黏附能力與其表面蛋白類(lèi)物質(zhì)及其他大分子物質(zhì)有關(guān)，本實(shí)驗(yàn)4 株菌的細(xì)胞黏附性各不相同，原因可能與菌體的自聚集能力和表面疏水性存在較大的相關(guān)性，但由于所用細(xì)胞不一樣，具體原因還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。

圖7 益生菌對(duì)HT-29細(xì)胞的黏附性Fig. 7 Adhesion of probiotics to HT-29 cells

2.3.8 主成分分析結(jié)果

將菌株ST-2、1.1881、GS-3、BLP12的α-葡萄糖苷酶抑制率和其他特性進(jìn)行整理和標(biāo)準(zhǔn)化處理，進(jìn)行主成分分析，篩選出性能最優(yōu)的降糖菌株。

圖8 碎石圖Fig. 8 Scree plot

表5 總方差分析Table 5 Total variance explained

表6 成分矩陣Table 6 Component matrix

圖9 主成分分析結(jié)果Fig. 9 PCA loadings and scores plots

表7 因子得分結(jié)果Table 7 Analysis of principal component scores

如圖8所示，優(yōu)良菌株8 個(gè)特征值中有3 個(gè)特征值的數(shù)值大于1，故可以將分析的特性指標(biāo)簡(jiǎn)化為3 個(gè)主成分。

由表5可知，第1主成分的方差貢獻(xiàn)率為50.468%，第2主成分的方差貢獻(xiàn)率為32.495%，第3主成分的方差貢獻(xiàn)率為17.037%。第1主成分和第2主成分的累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到了82.963%。說(shuō)明進(jìn)行分析的8 個(gè)特性可以簡(jiǎn)化為2 個(gè)主成分，可以解釋所有特性的82.963%。

由表6可以看出每個(gè)主成分在所分析特性上的成分載荷。圖9a是因子載荷圖，是表6的直觀表現(xiàn)，為各個(gè)特性在各主成分中占的載荷分布圖。第1主成分可以解釋5 個(gè)特性：其成分載荷分別為胃腸道轉(zhuǎn)運(yùn)性0.976、對(duì)模擬胃液的耐受性0.943、對(duì)模擬腸液的耐受性0.854、耐酸性0.751、對(duì)膽鹽的耐受性0.721；第2主成分主要解釋2 個(gè)特性：α-葡萄糖苷酶抑制率0.979、細(xì)胞黏附性0.934。

圖9b是因子得分圖，其展示了所選益生菌的分布，根據(jù)圖9b和表7可以看出，菌株BLP12的綜合得分最高，為51.42，明顯高于其他3 種菌株，1.1881的綜合得分最低。這一結(jié)果表明，BLP12可作為潛在的降糖益生菌株。

3 討論與結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以實(shí)驗(yàn)室保藏的77 株益生菌為研究對(duì)象，從菌株的CFS和CFE分析益生菌對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性，以期篩選出能夠通過(guò)抑制α-葡萄糖苷酶活性而發(fā)揮降糖作用的益生菌。結(jié)果表明，當(dāng)菌株濃度為1×109CFU/mL時(shí)，多數(shù)菌株的CFS對(duì)α-葡萄糖苷酶具有抑制作用，并且有7 株益生菌的抑制率達(dá)到了10%及以上，抑制作用明顯，而77 株益生菌的CFE對(duì)α-葡萄糖苷酶未呈現(xiàn)抑制作用。Zeng Zhu等[19]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)菌液的濃度為1×1010CFU/mL時(shí)，L. rhamnosus GG的CFS對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率為28.3%，CFE抑制率為2.5%；L. plantarum ZF06-3的CFS對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率為34.9%，CFE沒(méi)有抑制作用等，總體結(jié)果中有少數(shù)幾株菌的CFE也沒(méi)有檢測(cè)到抑制作用，說(shuō)明多數(shù)菌株的CFS提取物中含有抑制α-葡萄糖苷酶活性的物質(zhì)。陳佩等[13]研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)菌液濃度為1×109CFU/mL時(shí)，干酪乳桿菌CCFM0412的培養(yǎng)上清液具有較好的α-葡萄糖苷酶活性的抑制率（29.61%）及較高的抗氧化能力。本實(shí)驗(yàn)篩選得到的最優(yōu)菌株為BLP12，其CFS的α-葡萄糖苷酶抑制率為15.101%，與Zeng Zhu等[19]的結(jié)果相比其抑制率較低，但菌液濃度也很低，隨著菌液濃度的增大，菌株BLP12抑制活性也會(huì)增加；與陳佩等[13]的研究相比，因提取物制備方法不同，抑制率低于其所選的最優(yōu)菌株。篩選得到具有較強(qiáng)α-葡萄糖苷酶抑制活性的菌株編號(hào)為ST-2、1.1881、GS-3、BLP12，經(jīng)鑒定為干酪乳桿菌和植物乳桿菌，與目前報(bào)道的多數(shù)具有降糖作用益生菌的種屬關(guān)系一致。

為了保證所選益生菌的降糖功能有效發(fā)揮，對(duì)菌株進(jìn)行益生特性的評(píng)價(jià)。在耐酸性實(shí)驗(yàn)中，編號(hào)為ST-2、1.1881、GS-3、BLP12的4 株菌在pH 3.0的條件下均存活性良好，在pH 2.0的條件下，僅菌株1.1881對(duì)酸表現(xiàn)為敏感；在對(duì)膽鹽的耐受性實(shí)驗(yàn)中，在高濃度2.0%的膽鹽濃度下，4 株菌的存活率不一，其中菌株ST-2對(duì)膽鹽的耐受性最好，能達(dá)到1.63%，活菌數(shù)為2.86×107CFU/mL；在對(duì)HT-29細(xì)胞的黏附性實(shí)驗(yàn)中，各菌株間出現(xiàn)了差異，菌株ST-2和1.1881的黏附率明顯高于菌株GS-3和BLP12。

本實(shí)驗(yàn)為了更加真實(shí)地模擬人體消化道環(huán)境，根據(jù)Versantvoort等[25]方法配制了消化液，其中不僅含有胰蛋白酶、胃蛋白酶，還含有黏蛋白酶II、III，溶菌酶等，此外添加了各種無(wú)機(jī)鹽（KCl、MgCl2、NaH2PO4等）。在模擬唾液中，菌株ST-2、1.1881、GS-3、BLP12均表現(xiàn)狀況良好，生長(zhǎng)未受到影響；在pH 2.0的模擬胃液孵育3 h時(shí)，菌株ST-2、GS-3、BLP12在pH 2.0培養(yǎng)液條件下的存活率均大于在模擬胃液中的存活率，可能是由于模擬胃液中的胃蛋白酶對(duì)其產(chǎn)生了抑制作用；在模擬腸液中，4 株菌株表現(xiàn)出了很好的耐受性，存活率均能達(dá)到75%及以上，原因可能是本實(shí)驗(yàn)中的人工模擬腸液添加了牛血清蛋白和黏蛋白，黏蛋白可以作為細(xì)菌的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)提供碳源[31]，同時(shí)模擬腸液中未添加膽鹽，這些都會(huì)導(dǎo)致菌體在模擬腸液中存活率有所提高。且供試菌株在經(jīng)口腔、胃腸道連續(xù)消化約1 d后，存活率基本能達(dá)90%，其中菌株1.1881、GS-3、BB12在連續(xù)消化后的存活率高于在模擬胃液中的存活率，這可能是模擬腸液中含有促進(jìn)菌株生長(zhǎng)的生長(zhǎng)因子（黏蛋白），因此各菌株在經(jīng)過(guò)模擬唾液、胃液和腸液連續(xù)消化后的存活率會(huì)很高，使其能夠很好地對(duì)宿主發(fā)揮作用。

本研究所篩選出具有高α-葡萄糖苷酶抑制活性的菌株為ST-2、1.1881、GS-3、BLP12，其益生特性均各有特色和不足。利用主成分分析對(duì)包括α-葡萄糖苷酶抑制率及各種模擬體內(nèi)環(huán)境的益生特性進(jìn)行綜合評(píng)估結(jié)果顯示，菌株BLP12的得分最高，可以很好地通過(guò)消化道的各種屏障而發(fā)揮其降糖功能。本實(shí)驗(yàn)篩選到降糖菌株后，下一步將會(huì)對(duì)BLP12進(jìn)行動(dòng)物喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步驗(yàn)證其降糖效果。