具有α-葡萄糖苷酶抑制作用益生菌的篩選及特性分析

王 芬，劉 鷺，李函彤，張書文，蘆 晶，逄曉陽，汪建明,*，呂加平,*

糖尿病是一種由于胰島素分泌不足（I型）或胰島素抵抗（II型）引起的一種內分泌代謝紊亂性疾病，其特點是慢性高血糖癥[1]。目前糖尿病已成為一種主要的慢性疾病，對人類的生活和健康造成了巨大的損害[2]，其中多數患者為II型糖尿病，主要特征有高血糖、低度炎癥、β細胞損壞、胰島素抵抗及系列并發癥[3]。根據世界衛生組織的數據顯示，至2017年，中國糖尿病的患病率已居世界首位，人數約1.1億，約占中國成年人總數的1/10。依照目前發展趨勢，到2040年，我國患者將超過1.5億。因此，急需通過有效措施預防和治療糖尿病。

食物中的碳水化合物在腸道內主要以單糖的形式被吸收。人體攝入的淀粉等多糖物質被唾液和胰α-淀粉酶降解生成寡糖及二糖后，還需要在腸道黏膜α-葡萄糖苷酶的作用下酶解生成葡萄糖后才能被吸收[4]。因此，α-葡萄糖苷酶已成為抑制碳水化合物吸收、降低血糖藥物開發的有效靶點。目前，已在臨床上應用的α-葡萄糖苷酶抑制劑類降血糖藥物主要有阿卡波糖、伏格列波糖、米格列醇[5]。α-葡萄糖苷酶抑制劑主要通過可逆性競爭α-葡萄糖苷酶與糖的結合位點，限制或延緩碳水化合物在腸內的分解和吸收，有效推遲并減輕糖尿病人餐后血糖升高的時間及進程，進而發揮降糖作用[6]，因此，α-葡萄糖苷酶抑制劑主要適用于以碳水化合物為主食的人群，特別是中老年糖尿病患者[7]。

目前大量研究表明，一些益生菌的降血糖、抗氧化能力對人類II型糖尿病的治療起到了有益的作用。Lactobacillus rhamnosus CCFM0528可以顯著降低STZ誘導的II型糖尿病小鼠的空腹、餐后血糖、糖基化血紅蛋白、內毒素、腫瘤壞死因子、白細胞介素-6和白細胞介素-8水平[8]。Ejtahed等[9]發現嗜酸乳桿菌和雙歧桿菌可以改善II型糖尿病人的空腹血糖。何秋雯[10]報道益生菌干酪乳桿菌（L. casei Zhang）對預防和穩定STZ所致的II型糖尿病大鼠的血糖升高、血液及尿液電解質紊亂具有一定的改善作用。乳酸菌G15和Q14能夠顯著改善糖尿病大鼠的糖耐量，降低糖基化血紅蛋白，改善II型糖尿病大鼠胰島β細胞受損及體重減輕的癥狀[11]。Moroti等[12]發現嗜酸乳桿菌和雙歧桿菌顯著降低糖尿病老年患者血糖水平。Chen Pei等[13]報道干酪乳桿菌CCFM0412具有較好的α-葡萄糖苷酶酶活的抑制率（29.61%）及較高的抗氧化能力。

2001年，聯合國糧農組織/世界衛生組織對益生菌的定義是“攝入量足夠時對機體產生有益作用的活性微生物”[14]。Del Piano等[15]認為益生菌應該是“在一定程度上能耐受胃液，膽汁和胰臟分泌物而黏附于腸道上皮細胞，并在空腸和回腸大量繁殖的一類活的微生物”。因此，菌體細胞對胃腸道環境具有較高的耐受性對于發揮益生作用至關重要[16-17]。本實驗從菌株的細胞代謝物（cell-free excretory supernatants，CFS）和細胞內容物（cell-free extracts，CFE）對實驗室保藏的77 株益生菌進行了降糖作用的篩選；在此基礎上，充分模擬人體的消化環境對篩選的菌株進行評估；最后通過主成分分析篩選出1 株既具有潛在α-葡萄糖苷酶抑制作用又能很好的在體內生存的益生菌。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

77 株益生菌（表1）由中國農業科學院農產品加工研究所乳品實驗室保藏。

4-硝基苯基-D-吡喃葡糖苷（4-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside，PNPG）、α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶、黏蛋白II、黏蛋白III、溶菌酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、膽鹽、cFDA-SE染液 美國Sigma公司；其余試劑均為分析純。

表1 77 株菌株來源及編號Table 1 Information about 77 probiotic strains

續表1

1.2 儀器與設備

LDZX-50KB立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫療器械廠；SK15離心機 美國Sigma公司；JY92-IIN超聲波細胞破碎機 寧波新芝生物科技股份有限公司；SPARK 20M多功能酶標儀 瑞士Tecan公司；BD FACSCalibur流式細胞儀、聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀 日本Takara公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種的活化及其菌落總數的測定

將凍存于-80 ℃的77 株甘油管保藏的益生菌接入MRS肉湯培養基中，于37 ℃恒溫靜置培養18 h，活化3 代后用于后續實驗。

將活化好的菌株以體積分數4%的接種量接入MRS肉湯培養基中，于37 ℃靜置培養18 h，收集菌液，根據GB 4789.2—2010《食品微生物學檢驗 菌落總數測定》[18]進行菌株菌落總數的測定，將菌液濃度調節為1×109CFU/mL。

1.3.2 樣品的制備

1.3.2.1 CFS的制備[19]

益生菌在MRS培養基中37 ℃靜置培養18 h后，于4 ℃、12 000 r/min離心15 min收集菌體。將收集到的菌體用0.1 mol/L無菌PBS（pH 6.8）洗滌3 次，再重懸于PBS中，調節菌液濃度至1×109CFU/mL，混勻。于37 ℃孵育12 h，于4 ℃、12 000 r/min離心15 min，收集上清液，以0.22 μm水系微濾膜過濾得到CFS，-80 ℃保存。

1.3.2.2 CFE的制備[18]

益生菌在MRS培養基中37 ℃靜置培養18 h后，于4 ℃、12 000 r/min離心15 min收集菌體。將收集到的菌體用0.1 mol/L無菌PBS（pH 6.8）洗滌3 次，再重懸于PBS中，調節菌液濃度至1×109CFU/mL，混勻，進行超聲破碎。超聲破碎條件：在冰浴的條件下，功率200 W，以3～5 s（工作3 s，停5 s）的脈沖破碎12 min。將超聲后得到的液體于4 ℃、12 000 r/min離心15 min，收集上清液，以0.22 μm水系微濾膜過濾得到CFE，-80 ℃保存。

1.3.3 α-葡萄糖苷酶抑制活性的測定[20]

取96 孔酶標板，用微量移液器在反應孔中加入25 μL 20 mmol/L的PNPG及25 μL CFS或CFE，于37 ℃孵育10 min，再加入0.01 U/mL的α-葡萄糖苷酶50 μL，37 ℃反應15 min，最后加入100 μL的0.1 mol/L的Na2CO3溶液終止反應，用酶標儀于405 nm波長處測定反應液的吸光度。用阿卡波糖作陽性對照，按公式（1）計算[21]：

式中：A1為含有酶不含樣品的吸光度，樣品用0.1 mol/L的PBS（pH 6.8）代替；A2為不含酶不含樣品的0.1 mol/L的PBS（pH 6.8）吸光度；A3為含有酶含有樣品的吸光度；A4為不含酶含有樣品樣液吸光度，酶用0.1 mol/L的PBS（pH 6.8）代替。

1.3.4 16S rDNA基因測序

將篩選得到的菌株按體積分數4%（下同）的接種量接入MRS肉湯培養基中，于37 ℃靜置培養18 h。取2 mL菌液按細菌基因組DNA提取試劑盒提取基因組。用瓊脂糖凝膠電泳法和紫外分光光度法檢測分析DNA的純度及濃度，用細菌16S rDNA擴增通用引物27F（5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’）和1492R（5’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’）進行擴增[20]。采用瓊脂糖凝膠電泳法對擴增產物進行檢測。最后將擴增出的產物由北京華大基因研究中心完成測序。反應體系為DNA模板1 μL；Mix 12.5 μL；上下游引物各1 μL；加ddH2O 9.5 μL至總體積為25 μL。PCR條件為：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性30 s；62 ℃退火30 s；72 ℃延伸30 s，共35 個循環；第35個循環72 ℃延伸10 min。

1.3.5 益生特性的測定

1.3.5.1 益生菌耐酸性的測定

將益生菌以4%的接種量接入MRS肉湯培養基中，于37 ℃靜置培養18 h，在4 ℃、6 000 r/min離心10 min，收集菌體。將收集到的菌體重懸于pH 2.0、3.0、7.0[23]的MRS肉湯培養基中，調節菌液濃度至1×109CFU/mL。于37 ℃孵育3 h，收集菌液，根據GB 4789.2—2010進行活菌計數。耐受性以存活率計算，見式（2）[24]：

式中：N1為經過耐受處理條件下的活菌數/（CFU/mL）；N0為pH 6.4（正常）MRS肉湯培養基中的活菌數/（CFU/mL）。

1.3.5.2 益生菌耐膽鹽的測定

將益生菌以4%的接種量接入MRS肉湯培養基中，于37 ℃靜置培養18 h，于4 ℃、6 000 r/min離心10 min，收集菌體。將收集到的菌體重懸于pH 8.0、含2%膽鹽的無菌去離子水中[22]，調節菌液濃度至1×109CFU/mL。于37 ℃孵育24 h，收集菌液，根據GB 4789.2—2010進行活菌計數。耐受性的計算同公式（2）。

1.3.5.3 益生菌在人工模擬唾液、胃液、腸液中生長的測定

參考Versantvoort等[25]的方法配制模擬消化液，充分模擬人體口腔，胃腸道中的消化環境。

將益生菌以4%的接種量接入MRS肉湯培養基中，于37 ℃靜置培養18 h，于4 ℃、6 000 r/min離心10 min，收集菌體。將收集到的菌體分別重懸于人工模擬的唾液（pH 7.0）、胃液（pH 2.0）、腸液（pH 8.0）中，調節菌液濃度至1×109CFU/mL。于37 ℃各環境分別孵育5 min、3 h、24 h，收集菌液，根據GB 4789.2—2010進行活菌計數。計算同公式（2）。

1.3.5.4 益生菌體外模擬的消化實驗[26]

將益生菌以4%的接種量接入MRS肉湯培養基中，于37 ℃靜置培養18 h，于4 ℃、6 000 r/min離心10 min，收集菌體。將收集到的菌體重懸于pH 7.0的模擬唾液中，調節菌液濃度至1×109CFU/mL。于37 ℃孵育5 min，4 ℃、6 000 r/min離心10 min，收集菌體；將收集到的菌體繼續重懸于pH 2.0的模擬胃液中，于37 ℃孵育3 h，4 ℃、6 000 r/min離心10 min，收集菌體；最后再將收集的菌體重懸于pH 8.0的模擬腸液中，于37 ℃孵育24 h，收集菌液，根據GB 4789.2—2010進行活菌計數。計算公式同式（2）。

1.3.5.5 益生菌對HT-29細胞黏附性的測定

cFDA-SE對益生菌的熒光標記[22]：用二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）配制1 mmol/L cFDA-SE的貯備液（稱取5.0 mg cFDA-SE溶解于8.969 mL的DMSO試劑中），0.22 μm水系微濾膜過濾除菌，-20 ℃貯存備用。將篩選得到的益生菌以4%的接種量接入MRS肉湯培養基中，于37 ℃靜置培養18 h，4 ℃、3 000×g離心5 min，棄上清液，收集菌體。將收集到的菌體用無菌PBS洗3 次，重懸于PBS溶液中，調節菌液濃度至1×109CFU/mL。加入cFDA-SE貯液（1 mmol/L）至終濃度為20 μmol/L，于37 ℃避光靜置20 min，4 ℃離心（5 000×g，10 min），棄上清液，收集菌體。再用PBS洗3 次，將菌體重懸于PBS溶液中，于488 nm激發波長下進行流式細胞檢測，分析cFDA-SE的標記率。

HT-29細胞的培養：將HT-29細胞進行復蘇后，按照1∶3的比例進行傳代，傳至新的培養瓶中，觀察細胞生長狀態。每1～2 d換液1 次，待細胞匯合度長至90%左右，棄去培養液，用PBS洗3 次，加入1 mL 0.25%胰酶，于37 ℃、5% CO2恒溫培養箱中消化2 min，棄去胰酶，加入培養液終止消化，進行細胞計數，調整細胞數至1×105個/mL，進行鋪板，觀察細胞生長狀態，待培養板中細胞匯合度長至90%～100%時即可進行細菌黏附實驗。

益生菌對HT-29細胞的黏附性實驗：將在24 孔板中培養好的HT-29細胞，用PBS洗3 次，分別加入500 μL的PBS，cFDA-SE標記的益生菌菌懸液；對照組為空白孔＋500 μL cFDA-SE標記的益生菌菌懸液。于37 ℃、5% CO2培養箱中孵育2 h，用無菌PBS洗3 次。每孔加入350 μL 0.25%胰酶，于CO2培養箱中消化10 min，待細胞與培養板底部完全脫落，加入150 μL細胞培養液終止消化，混勻，取出100 μL懸液轉入96 孔板中，用錫箔紙包好，測定其熒光強度。熒光檢測條件：激發波長為485 nm，發射波長為530 nm。黏附率的計算為式（3）：

式中：A為HT-29細胞＋cFDA-SE標記的細菌菌懸液吸光度；A0為HT-29細胞＋PBS的吸光度；A1為cFDA-SE標記的細菌菌懸液吸光度。

1.3.6 主成分分析

篩選出具有高α-葡萄糖苷酶抑制活性的菌株，對篩選菌株的α-葡萄糖苷酶抑制活性、耐酸性、膽鹽耐受性、細胞黏附性及模擬胃腸液的耐受性等指標用SPSS 17.0軟件進行主成分分析，篩選出可以很好地在胃腸發揮α-葡萄糖苷酶抑制活性的菌株。

1.4 數據分析

所有數據用 ±s表示，采用SPSS 17.0進行統計分析，利用Origin 8.0、Excel進行繪圖分析。

2 結果與分析

2.1 具有α-葡萄糖苷酶抑制活性菌株的篩選結果

由表2可以看出，篩選的13 株益生菌的CFS均表現出對α-葡萄糖苷酶的活性有抑制作用，抑制率可以達到2.53%～15.76%。陽性對照組阿卡波糖的抑制率最高，為26.75%；7 株益生菌的抑制率達到了10%以上，其中菌株GS-3對α-葡萄糖苷酶的抑制率最高，為15.76%；菌株BLP12、ST-2、1.1881的抑制率略低，分別為15.10%、13.44%、12.12%，該4 種菌株對α-葡萄糖苷酶的抑制活性均可以達到陽性對照組阿卡波糖抑制活性的50%。且77 株益生菌的CFE對α-葡萄糖苷酶未呈現抑制作用，說明實驗菌株的CFS提取物中含有抑制α-葡萄糖苷酶活性的物質，而CFE中不含或含有極少的該類抑制物，具體的結果還需要進一步的研究。根據抑制率結果，選出菌株GS-3、BLP12、ST-2、1.1881這4 株菌株進行體外模擬環境的耐受性實驗。

表2 益生菌對α-葡萄糖苷酶酶活的抑制率Table 2 α-Glucosidase inhibitory rates of probiotics

2.2 16S rDNA基因測序結果

對篩選得到的4 株具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的菌株進行菌種鑒定，由表3可以看出，該4 株菌分別屬于干酪乳桿菌和植物乳桿菌。

2.3 益生特性的測定結果

益生菌類制劑在被人或動物食用后，只有在大量活菌順利抵達、黏附并成功定植于回腸和結腸部位時，才能對宿主發揮益生作用[28]。在這一消化過程中，口腔中的環境，胃部的低pH值環境及胃液中胃蛋白酶等抗菌物質就成為阻礙益生菌進入腸道的第一道天然屏障。

2.3.1 益生菌的耐酸性

由圖1可知，菌株編號為ST-2、1.1881、GS-3、BLP12的菌株在pH 3.0的酸性條件下孵育3 h后，均表現出了很高的存活率，分別為96.75%、108.69%、100.50%、96.93%，存活率均大于95%，其中GS-3、1.1881的存活率大于100%。分析有可能是pH 3.0的條件對GS-3、1.1881的生長無影響，甚至適宜這兩株菌的生存，因此孵育期間反而增殖，造成存活率變高。此外，在pH 2.0的條件下，ST-2、GS-3、BLP12存活率很高，達到了70%。其中菌株ST-2的存活率最高，達到了75.97%；而菌株1.1881在pH 2.0的條件下存活率很低，僅為6.19%，說明其對酸敏感。總體來看，這3 株菌在這2 個pH值下的生存趨勢是一致的。Matsumoto等[29]研究發現菌株的耐酸能力大小與菌株的H＋-ATP酶活性有關。因此，本實驗中的干酪乳桿菌具有較好的耐酸能力，可能與其H＋-ATP酶活性有關。

圖1 益生菌對酸性條件的耐受性Fig. 1 Tolerance of probiotics to low pH

2.3.2 益生菌對膽鹽的耐受性

圖2 益生菌對膽鹽的耐受性Fig. 2 Tolerance of probiotics to bile salt

由圖2可知，菌株編號為ST-2、1.1881、GS-3、BLP12的菌株在含2%膽鹽的去離子水中孵育24 h后，生長狀況不一。其中菌株ST-2的存活率最高，能達到1.63%，活菌數能達到2.86×107CFU/mL，菌株BLP12的存活率略低，為0.70%，且活菌數為1.96×107CFU/mL，編號1.1881的菌株存活率最低，活菌數達到1×105CFU/mL，說明不同菌株對膽鹽的耐受性不同。

2.3.3 益生菌在模擬唾液中的耐受性

由圖3可知，菌株編號為ST-2、1.1881、GS-3、BLP12的菌株在模擬唾液中的生長狀況良好。以pH 7.0的MRS肉湯培養基中的活菌數為對照時，存活率均達到了94%以上；以pH 6.4的MRS肉湯培養基中的活菌數為對照時，存活率均達到了97%以上，菌株ST-2和菌株GS-3的存活率超過了100%；且這4 株菌株均更適宜在pH 7.0生長，同時可以看出無論以哪種條件為對照，結果均是菌株GS-3的存活率最高，ST-2次之，且各菌株之間的存活率沒有顯著差異。

圖3 益生菌在模擬唾液中的耐受性Fig. 3 Tolerance of probiotics to simulated saliva

2.3.4 益生菌在模擬胃液中的耐受性

圖4 益生菌在模擬胃液中的耐受性Fig. 4 Tolerance of probiotics to the simulated gastric juice

由圖4可知，菌株編號為ST-2、1.1881、GS-3、BLP12的菌株在模擬胃液中生長情況不一，其中，菌株ST-2、GS-3存活率較高，分別為76.65%，68.81%；菌株1.1881、BLP12的存活率較低，分別為47.32%、52.49%，基本能達到50%左右。同時菌株ST-2、GS-3、BLP12在pH 2.0 MRS肉湯培養基中的存活率均大于在模擬胃液中的存活率，其中ST-2、GS-3的存活率在兩種環境下的差異不大，但菌株BLP12在pH 2.0 MRS肉湯培養基中的存活率明顯高于在模擬胃液中的存活率。與上述3 株菌不同的是，菌株1.1881在pH 2.0 MRS肉湯培養基中的存活率明顯低于在模擬胃液中的存活率。

2.3.5 益生菌在模擬腸液中的耐受性

由圖5可知，菌株編號為ST-2、1.1881、GS-3、BLP12的菌株在模擬腸液中的生長狀況良好，其中菌株1.1881、GS-3、BLP12的存活率均大于90%，菌株ST-2的存活率略低，為74.68%，基本達到了75%。

圖5 益生菌在模擬腸液中的耐受性Fig. 5 Tolerance of probiotics to simulated intestinal juice

2.3.6 益生菌經模擬唾液、胃液、腸液消化后的存活率

圖6 益生菌經模擬唾液、胃液、腸液消化后的存活率Fig. 6 Tolerance of probiotics to simulated digestive juice

由圖6可知，菌株編號為ST-2、1.1881、GS-3、BLP12的菌株在經過模擬唾液、胃液、腸液消化后生長狀況良好，存活率分別為90.13%、88.62%、89.49%、88.27%，基本達到了90%左右，且各菌株之間差異很小，可以很好地在模擬環境中生存，至少存活24 h。

2.3.7 益生菌對HT-29細胞黏附性結果

2.3.7.1 cFDA-SE熒光標記結果

表4 cFDA-SE對益生菌菌體細胞的標記率Table 4 Labeling rate of cFDA-SE on probiotics

由表4可以看出，cFDA-SE對這4 株菌的標記率都很高，標記率均大于85%，其中菌株1.1881的標記率最高，為89.60%，且菌株1.1881、BLP12與ST-2、GS-3之間的菌體標記效果有顯著性差異（P＜0.05），但不同菌體細胞標記率間的差值最大僅為2.8%，差值較小。

2.3.7.2 益生菌對HT-29細胞的黏附性

由圖7可知，菌株編號為ST-2、1.1881、GS-3、BLP12的菌株對HT-29細胞的黏附率各不相同。黏附率范圍為1.31%～16.34%，其中菌株ST-2和1.1881的黏附率明顯高于另外2 株菌，分別為16.34%、12.31%，能達到10%以上；而菌株GS-3（1.31%）、BLP12（1.93%）的黏附率很低，二者均未達到2.0%，與菌株ST-2和1.1881的黏附性有顯著性差異（P＜0.05）。李清等[30]研究表明菌株對Caco-2細胞的黏附能力與其表面蛋白類物質及其他大分子物質有關，本實驗4 株菌的細胞黏附性各不相同，原因可能與菌體的自聚集能力和表面疏水性存在較大的相關性，但由于所用細胞不一樣，具體原因還需要進一步的實驗。

圖7 益生菌對HT-29細胞的黏附性Fig. 7 Adhesion of probiotics to HT-29 cells

2.3.8 主成分分析結果

將菌株ST-2、1.1881、GS-3、BLP12的α-葡萄糖苷酶抑制率和其他特性進行整理和標準化處理，進行主成分分析，篩選出性能最優的降糖菌株。

圖8 碎石圖Fig. 8 Scree plot

表5 總方差分析Table 5 Total variance explained

表6 成分矩陣Table 6 Component matrix

圖9 主成分分析結果Fig. 9 PCA loadings and scores plots

表7 因子得分結果Table 7 Analysis of principal component scores

如圖8所示，優良菌株8 個特征值中有3 個特征值的數值大于1，故可以將分析的特性指標簡化為3 個主成分。

由表5可知，第1主成分的方差貢獻率為50.468%，第2主成分的方差貢獻率為32.495%，第3主成分的方差貢獻率為17.037%。第1主成分和第2主成分的累計貢獻率達到了82.963%。說明進行分析的8 個特性可以簡化為2 個主成分，可以解釋所有特性的82.963%。

由表6可以看出每個主成分在所分析特性上的成分載荷。圖9a是因子載荷圖，是表6的直觀表現，為各個特性在各主成分中占的載荷分布圖。第1主成分可以解釋5 個特性：其成分載荷分別為胃腸道轉運性0.976、對模擬胃液的耐受性0.943、對模擬腸液的耐受性0.854、耐酸性0.751、對膽鹽的耐受性0.721；第2主成分主要解釋2 個特性：α-葡萄糖苷酶抑制率0.979、細胞黏附性0.934。

圖9b是因子得分圖，其展示了所選益生菌的分布，根據圖9b和表7可以看出，菌株BLP12的綜合得分最高，為51.42，明顯高于其他3 種菌株，1.1881的綜合得分最低。這一結果表明，BLP12可作為潛在的降糖益生菌株。

3 討論與結論

本實驗以實驗室保藏的77 株益生菌為研究對象，從菌株的CFS和CFE分析益生菌對α-葡萄糖苷酶的抑制活性，以期篩選出能夠通過抑制α-葡萄糖苷酶活性而發揮降糖作用的益生菌。結果表明，當菌株濃度為1×109CFU/mL時，多數菌株的CFS對α-葡萄糖苷酶具有抑制作用，并且有7 株益生菌的抑制率達到了10%及以上，抑制作用明顯，而77 株益生菌的CFE對α-葡萄糖苷酶未呈現抑制作用。Zeng Zhu等[19]研究發現，當菌液的濃度為1×1010CFU/mL時，L. rhamnosus GG的CFS對α-葡萄糖苷酶的抑制率為28.3%，CFE抑制率為2.5%；L. plantarum ZF06-3的CFS對α-葡萄糖苷酶的抑制率為34.9%，CFE沒有抑制作用等，總體結果中有少數幾株菌的CFE也沒有檢測到抑制作用，說明多數菌株的CFS提取物中含有抑制α-葡萄糖苷酶活性的物質。陳佩等[13]研究發現當菌液濃度為1×109CFU/mL時，干酪乳桿菌CCFM0412的培養上清液具有較好的α-葡萄糖苷酶活性的抑制率（29.61%）及較高的抗氧化能力。本實驗篩選得到的最優菌株為BLP12，其CFS的α-葡萄糖苷酶抑制率為15.101%，與Zeng Zhu等[19]的結果相比其抑制率較低，但菌液濃度也很低，隨著菌液濃度的增大，菌株BLP12抑制活性也會增加；與陳佩等[13]的研究相比，因提取物制備方法不同，抑制率低于其所選的最優菌株。篩選得到具有較強α-葡萄糖苷酶抑制活性的菌株編號為ST-2、1.1881、GS-3、BLP12，經鑒定為干酪乳桿菌和植物乳桿菌，與目前報道的多數具有降糖作用益生菌的種屬關系一致。

為了保證所選益生菌的降糖功能有效發揮，對菌株進行益生特性的評價。在耐酸性實驗中，編號為ST-2、1.1881、GS-3、BLP12的4 株菌在pH 3.0的條件下均存活性良好，在pH 2.0的條件下，僅菌株1.1881對酸表現為敏感；在對膽鹽的耐受性實驗中，在高濃度2.0%的膽鹽濃度下，4 株菌的存活率不一，其中菌株ST-2對膽鹽的耐受性最好，能達到1.63%，活菌數為2.86×107CFU/mL；在對HT-29細胞的黏附性實驗中，各菌株間出現了差異，菌株ST-2和1.1881的黏附率明顯高于菌株GS-3和BLP12。

本實驗為了更加真實地模擬人體消化道環境，根據Versantvoort等[25]方法配制了消化液，其中不僅含有胰蛋白酶、胃蛋白酶，還含有黏蛋白酶II、III，溶菌酶等，此外添加了各種無機鹽（KCl、MgCl2、NaH2PO4等）。在模擬唾液中，菌株ST-2、1.1881、GS-3、BLP12均表現狀況良好，生長未受到影響；在pH 2.0的模擬胃液孵育3 h時，菌株ST-2、GS-3、BLP12在pH 2.0培養液條件下的存活率均大于在模擬胃液中的存活率，可能是由于模擬胃液中的胃蛋白酶對其產生了抑制作用；在模擬腸液中，4 株菌株表現出了很好的耐受性，存活率均能達到75%及以上，原因可能是本實驗中的人工模擬腸液添加了牛血清蛋白和黏蛋白，黏蛋白可以作為細菌的營養物質提供碳源[31]，同時模擬腸液中未添加膽鹽，這些都會導致菌體在模擬腸液中存活率有所提高。且供試菌株在經口腔、胃腸道連續消化約1 d后，存活率基本能達90%，其中菌株1.1881、GS-3、BB12在連續消化后的存活率高于在模擬胃液中的存活率，這可能是模擬腸液中含有促進菌株生長的生長因子（黏蛋白），因此各菌株在經過模擬唾液、胃液和腸液連續消化后的存活率會很高，使其能夠很好地對宿主發揮作用。

本研究所篩選出具有高α-葡萄糖苷酶抑制活性的菌株為ST-2、1.1881、GS-3、BLP12，其益生特性均各有特色和不足。利用主成分分析對包括α-葡萄糖苷酶抑制率及各種模擬體內環境的益生特性進行綜合評估結果顯示，菌株BLP12的得分最高，可以很好地通過消化道的各種屏障而發揮其降糖功能。本實驗篩選到降糖菌株后，下一步將會對BLP12進行動物喂養實驗，進一步驗證其降糖效果。