冷藏過程中三疣梭子蟹的營養物質變化

裴 峰，母昌考，王春琳，李榮華，葉央芳,*

作為我國重要的海洋經濟動物，三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）在2015年的海水養殖產量已達到12萬 t左右[1-2]。梭子蟹被捕獲后常被直接放入冰水中，然后曝氣培養在人工海水中用于銷售。大部分梭子蟹被消費者購買后很快被食用，然而仍有部分梭子蟹被置于冷藏條件下短暫保存。這些被冰水刺激過的梭子蟹極易死亡，它們首先在冷藏條件下進入低溫麻醉，繼而快速死亡。死亡后的梭子蟹在酶和微生物的作用下，其風味和品質開始下降，進而腐敗變質?，F有研究表明，梭子蟹在冷藏條件下肌肉三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）的含量持續下降，二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）、單磷酸腺苷（adenosine monophosphate，AMP）、肌苷酸（inosine monphosphate，IMP）和次黃嘌呤核苷的含量呈先上升后下降的趨勢，而次黃嘌呤和黃嘌呤的含量呈持續上升[3]。這些物質的變化改變了梭子蟹的鮮度和品質。然而，梭子蟹肌肉是一個復雜的混合物，除了這些核苷酸和核苷類物質外，還有多種有機物如氨基酸、有機酸和糖類等決定著梭子蟹肌肉的質量。如谷氨酸、甘氨酸和甜菜堿等是梭子蟹肌肉鮮味和甜味的主要貢獻者[4]。此外，梭子蟹的肝胰腺也是人們喜食的重要組織，因此，全面分析梭子蟹肌肉和肝胰腺中的營養物質在冷藏過程中的動態變化，可對梭子蟹在冷藏過程中的質量變化作出準確評價。

基于核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）的代謝組學方法是借助NMR波譜技術對所有低分子質量代謝物進行定性和定量分析的一種技術[5]。相比于傳統的食品分析方法，它可以同時檢測成百上千種有機化合物單體[6]，從有機分子水平更精確地解析食品的組分，從而達到系統和客觀地評價食品質量的目的。在食品科學領域，該手段被廣泛應用于食品組分分析[7-8]、食品質量鑒別[9-10]、食品質量控制[11-12]、食品貯存和加工[13-14]等方面。特別值得一提的是，該技術也已成功鑒別了不同級別的蟹糊[15]，并解析了蟹糊發酵過程中的營養物質變化[16]。因此，本研究采用基于NMR的代謝組學技術分析冷藏過程中梭子蟹營養物質的動態變化，為梭子蟹的貯藏和質量評價提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮活三疣梭子蟹購自寧?？h一養殖場，置于冰水混合物中運回實驗室。選取50 只雄性梭子蟹，每只梭子蟹的體質量為（130±20）g。

甲醇、二水合磷酸二氫鈉、三水合磷酸氫二鉀（均為色譜純） 上海國藥集團化學試劑有限公司；2,2,3,3-氘代三甲基硅烷丙酸鈉（sodium 3-trimethylsilyl [2,2,3,3-2D4] propionate，TSP）、重水（99.9%氘代）（均為色譜純） 美國Sigma-Aldrich公司。

用50%重水溶液配制0.15 mol/L磷酸緩沖液（pH 7.4），內含0.001% TSP[17]。配制甲醇溶液（甲醇-水2∶1，V/V）作為組織胞內物質的提取液。

1.2 儀器與設備

Avance III 600 MHz NMR儀（配有超低溫探頭）德國Bruker Biospin公司；TD-XBYM組織破碎儀 北京同德創業科技有限公司；5415R低溫高速離心機 德國Eppendorf公司；2.5 L冷凍干燥機 美國Labconco公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

把50 只梭子蟹隨機分成5 組，每組10 只，置于（4±1）℃海水中保存。分別于0、1、2、3 d和4 d的下午18:00取樣。采集每個梭子蟹的游泳足肌肉和肝胰腺各約500 mg，用液氮速凍后置于-80 ℃保存備用。

1.3.2 營養物質分析

1.3.2.1 營養物質提取

為提取梭子蟹肌肉和肝胰腺組織中的胞內物質，把1 mL提取液加入到每個樣品中，置于組織破碎儀中，設置破碎頻率為20 Hz，破碎時間為90 s。所得提取物在4 ℃、12 000 r/min離心10 min，以獲得上清液。殘渣再用1 mL甲醇溶液提取液提取1 次。合并2 次提取所得的上清液，置于真空條件下揮發上清液中的甲醇，再進一步冷凍干燥。在冷凍干燥粉中加入600 μL磷酸緩沖液，在4 ℃、12 000 r/min離心10 min，把500 μL上清液移入直徑為5 mm的核磁管中，以用于核磁分析。

1.3.2.2 梭子蟹肌肉和肝胰腺提取物的NMR分析

在298 K條件下采集樣品的1H NMR譜，所用的脈沖序列是標準的NOESYGPPR1D：RD-90°-t1-90°-tm-90°-ACQ，對應的質子共振頻率為600.13 MHz。為抑制水峰，設置等待時間為2 s，混合時間為100 ms，并施加強度約50 Hz的低功率連續波。對于每個1H NMR譜，均設置90°脈沖寬度約10 μs，譜寬為δ 20，采樣點數為32 K，自由感應信號累加次數為64 次。把采集到的1H NMR譜的自由感應信號先乘以增寬因子為0.5 Hz的指數窗函數，再進行傅里葉變換，根據內標物TSP（δ 0.0）的化學位移，手動定標1H NMR譜，并作相位和基線校正。分別選擇一個具有肌肉和肝胰腺提取物典型1H NMR譜的樣品用于二維NMR譜采集，采集的二維NMR譜包括同核COSY和TOCSY譜，異核HSQC和HMBC譜。二維譜的實驗參數設置可參考婁永江等[18]。

1.3.2.3 NMR數據的多變量統計分析

為了對肌肉和肝胰腺樣品的1H NMR譜進行分段積分，選取譜區間為δ 9.7～0.8，去除δ 5.0～4.75和δ 3.38～3.35的信號區間以消除水和甲醇的干擾，設置積分區間為2.4 Hz。對積分數據進行重量歸一化處理以消除樣品之間的質量差異。把歸一化的NMR數據導入SIMCA-P＋軟件（V11.0，瑞典Umetrics公司），選擇標準化的數據處理模式對NMR數據作主成分分析（principal component analysis，PCA），PCA結果不僅可提供樣本的聚類情況，還可檢測離群樣本點。然后對NMR數據作正交偏最小二乘法判別分析（orthogonal projection to latent structure discriminant analysis，OPLS-DA），在OPLS-DA中，設置自動規格化的數據處理模式，并以NMR數據為X變量，以分組信息為Y變量。為驗證OPLS-DA模型的可靠性，采用9 倍交叉驗證的方法，如果驗證所得的Q2值越高說明模型的質量越高。此外，還采用交叉驗證的方差分析方法進一步驗證OPLS-DA模型的可靠性，如果所得P值小于0.05，則證明OPLS-DA模型是可靠的[19]。為獲得導致組間區分的物質，先對自動規格化的NMR數據作回溯轉換[20]，再借助MATLAB軟件制作OPLS-DA模型相對應的相關系數圖。相關系數圖上每個點具有不同的顏色，該顏色代表X變量（即回溯轉換處理后的NMR數據）和Y變量（即分組信息）之間的皮爾森積差相關系數（r）值。由于本研究設置樣本的重復數n為10，因此，只有當某一營養物質的|r|大于0.602時，才判定該物質對組間區分具有顯著意義（P＜0.05）。

為獲得冷藏后梭子蟹肌肉中核苷酸和核苷類物質含量的相對變化，本實驗計算了這些物質相對于冷藏第0天的相對變化率，計算公式如下：

式中：Ci和C0分別表示在冷藏后某一天和冷藏第0天時的營養物質相對濃度。

2 結果與分析

2.1 三疣梭子蟹肌肉和肝胰腺的營養物質組成

圖1 三疣梭子蟹肌肉和肝胰腺提取物的典型600 MHz 1H NMR譜Fig. 1 Typical 600 MHz 1H NMR spectra of muscle and hepatopancreas extracts of P. trituberculatus

表1 三疣梭子蟹肌肉和肝胰腺營養物質的NMR數據Table 1 NMR data of nutrients detected in the muscle and hepatopancreas of P. trituberculatus

續表1

依照梭子蟹肌肉樣品二維NMR譜提供的氫碳信息，并參考文獻[21-22]的物質歸屬信息，確定梭子蟹肌肉中含有30 種小分子有機化合物，包括14 種氨基酸（3 種支鏈氨基酸、絲氨酸、丙氨酸、蛋氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、賴氨酸、精氨酸、甘氨酸、組氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸）、4 種有機羧酸（?；撬帷⑷樗?、琥珀酸和延胡索酸）、4 種核苷和核苷酸類物質（肌苷、IMP、AMP和ATP）、2 種醇類（乙醇和2-吡啶甲醇）、2 種堿類（甜菜堿和葫蘆巴堿）、2 種糖類（葡萄糖和海藻糖）以及三甲基-N-氧化物（trimethylamine N-oxide，TMAO）和組胺，如圖1、表1所示。同樣，發現核磁共振方法可檢測到梭子蟹肝胰腺中的27 種小分子有機化合物。與肌肉相比，肝胰腺中未測到乙醇、琥珀酸、延胡索酸、組胺、IMP、AMP、ATP和海藻糖，但含有肌氨酸、色氨酸、琥珀酸亞胺、磷酸膽堿、膽堿-O-硫化物（圖1、表1）。這些物質組成的差異，可能與組織本身的結構和功能相關。

此外，比較肌肉和肝胰腺冷藏前后的核磁譜可以發現，冷藏對這2 種組織的代謝譜產生了顯著影響。如冷藏1 d導致了肌肉和肝胰腺物質組成的變化（圖1），肌肉中ATP的信號在冷藏后快速消失，取而代之于IMP、AMP和肌苷信號的增強；而更明顯的信號變化發生在肝胰腺的核磁譜中，大量的來自葡萄糖、蛋氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸等物質的信號明顯減弱。

2.2 冷藏對梭子蟹營養物質組成的影響

圖2 三疣梭子蟹肌肉和肝胰腺提取物的PCA軌跡圖Fig. 2 Trajectory derived from PCA of 1H NMR spectra of the muscle and hepatopancreas extracts of P. trituberculatus

消費者食用雄性梭子蟹的主要部位是肌肉和肝胰腺，因此本實驗以這2 個組織為研究對象，分析冷藏對梭子蟹營養物質組成的影響。為揭示肌肉和肝胰腺營養物組成的變化情況，首先對所有梭子蟹組織樣品的NMR數據做PCA，把所得的PC1和PC2用于制作軌跡圖，由圖2可知，肌肉和肝胰腺樣品隨著冷藏時間的延長，在PC1和PC2上均產生了明顯區分。肌肉的物質組成在冷藏前2 d變化顯著，而且第2天的變化比第1天更為顯著，而后2 d的變化較小。與肌肉相比，肝胰腺的物質組成變化主要發生在冷藏第1天，而后3 d的變化較小。

為進一步揭示梭子蟹組織中隨冷藏過程顯著變化的營養物質，對不同冷藏階段肌肉和肝胰腺樣品的NMR數據分別與冷藏前樣品作兩兩比較的OPLS-DA。首先對建立的8 個模型進行可靠性驗證，根據9 倍交叉驗證和交叉驗證的方差分析，這8 個OPLS-DA模型都是可靠的，如圖3、4所示。根據肌肉的OPLS-DA相關系數圖（圖3），冷藏1 d可導致ATP水平的顯著降低，而乳酸、TMAO、肌苷、IMP和AMP水平顯著升高。冷藏2 d可導致谷氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、牛磺酸和ATP的顯著降低，而肌苷水平顯著升高。冷藏3 d可導致精氨酸、牛磺酸和ATP的顯著降低，而肌苷水平顯著升高。冷藏4 d可導致谷氨酰胺、精氨酸、?；撬岷虯TP的顯著降低，而肌苷水平顯著升高。上述與冷藏顯著相關的肌肉營養物質的相關系數見表2。

鮮活的梭子蟹肌肉含有較高水平的ATP，在梭子蟹死亡后ATP快速水解成為ADP、AMP、IMP、肌苷和腺苷等，其中，AMP具有肉樣的鮮味[23]，而IMP具有牛肉湯樣的鮮味[24]，都是梭子蟹的重要呈味核苷酸[3]，是梭子蟹之所以味道鮮美的原因之一。本研究也發現，鮮活的梭子蟹肌肉含有較高水平的ATP，在冷藏1 d后，ATP即被分解了32.7%，2 d以后，ATP幾乎被完全分解（圖3、5）。而其代謝產物隨之在肌肉中大量積累，如AMP含量在冷藏第1天就增加了283.5%，2 d之后其含量呈下降趨勢，同時IMP含量也在冷藏第1天時達到最大值，隨之顯著降低。與這些核苷酸變化不同的是，肌苷水平在冷藏過程中快速升高，在冷藏第1天就升高到對照的277.3%，第2天達到對照的520.1%，第3天和第4天仍維持在對照的570%以上。肌苷賦予梭子蟹肌肉苦味[24]，因此，隨著冷藏時間的延長，梭子蟹肌肉的鮮味降低，苦味上升。這些核苷酸和核苷類物質的變化趨勢與宋雪等[3]研究結果類似（文獻中的次黃嘌呤核苷與本研究中的肌苷為同一物質），只是在物質的濃度變化幅度和變化時間上存在差異，這可能與樣品的處理方法和冷藏方式不同有關。然而，本研究并未檢測到在冷藏初期含量較低的ATP其他水解產物如ADP、腺苷、次黃嘌呤和黃嘌呤，這可能與NMR譜儀相比于液相色譜儀較低的靈敏度所致[25]。

圖3 冷藏后三疣梭子蟹肌肉提取物的OPLS-DA得分圖（A1～D1）和相關系數圖（A2～D2）Fig. 3 OPLS-DA scores plots (A1–D1) and corresponding color-coded correlation coefficient loadings plots (A2–D2) derived from NMR data for muscle extracts of swimming crab after chilled storage

圖4 冷藏后三疣梭子蟹肝胰腺提取物的OPLS-DA得分圖（A 1～D1） 和相關系數圖（A2～D2）Fig. 4 OPLS-DA scores plots (A1–D1) and corresponding color-coded correlation coefficient loadings plots (A2–D2) derived from NMR data for hepatopancreas extracts of swimming crab after chilled storage

表2 與冷藏相關的三疣梭子蟹肌肉和肝胰腺提取物中顯著改變的營養物質的OPLS-DA相關系數Table 2 OPLS-DA correlation coefficients for significant changes of nutrients in the muscle and hepatopancreas of P. trituberculatus associated with chilled storage

然而，基于NMR的代謝組學技術的優勢在于其對被檢測物質的無偏向性[25-26]，只要某有機物質的含量高于其檢測限，均能被檢測到。因此，本研究除了觀察到上述核苷酸和核苷類物質，還觀察到梭子蟹肌肉中乳酸、谷氨酸、精氨酸、?；撬岷蚑MAO水平在冷藏過程中的顯著波動。乳酸和谷氨酸可賦予梭子蟹肌肉柔和的酸味和強烈的鮮味，而精氨酸具有苦味[24]，這些物質的變化可能改變了梭子蟹原本的味道。而?；撬崾怯幸嬗谌梭w健康的活性物質[27]，該物質在冷藏過程中的持續減少，可能降低了梭子蟹肌肉的營養價值。此外，肌肉中的TMAO在梭子蟹冷藏第1天顯著升高，TMAO是海洋生物中普遍存在的滲透調節物質[28]，在冷藏第1天，梭子蟹仍然存活，可能為了抵抗低溫的脅迫，累積TMAO以維持肌肉細胞的滲透平衡。TMAO通常在梭子蟹死亡后被微生物或酶降解成為二甲胺或者三甲胺[29]，然而本研究并未檢出這2 種胺類物質，可能低溫保存抑制了微生物或酶的活性。三甲胺具有毒性[30]，經常被作為水產品新鮮度的指標[31]，因此，低溫海水保存的梭子蟹盡管其營養價值和口味下降，但在實驗期內（4 d）并未產生二甲胺或三甲胺等有害物質。

圖5 冷藏對三疣梭子蟹肌肉ATP、AMP和肌苷含量的影響Fig. 5 Effects of chilled storage on the levels of ATP, AMP, and inosine in the muscle of P. trituberculatus

與肌肉類似，本研究也對肝胰腺進行了兩兩比較的OPLS-DA分析。由圖4可知，冷藏1 d可導致包括11 種氨基酸水平的顯著降低，同時伴隨著甜菜堿、?；撬帷⑵咸烟?、TMAO、膽堿-O-硫酸和2-吡啶甲醇水平的顯著降低。冷藏2 d導致9 種氨基酸、甜菜堿、牛磺酸、葡萄糖、琥珀酸亞胺、TMAO、膽堿-O-硫酸和2-吡啶甲醇水平的顯著降低。冷藏第3、4天仍導致精氨酸、酪氨酸、甜菜堿、?；撬?、葡萄糖、琥珀酸亞胺、TMAO、膽堿-O-硫酸和2-吡啶甲醇水平的顯著降低，而乳酸水平開始顯著升高。另外，冷藏第4天還引起亮氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、苯丙氨酸和色氨酸水平的顯著降低。上述與冷藏顯著相關的肝胰腺營養物質的相關系數見表2。

與梭子蟹肌肉不同的是，肝胰腺在冷藏條件下的物質變化更為顯著，表現在更多營養物質的流失，特別是氨基酸的流失。氨基酸不僅是人體必要的營養物質，而且是重要的呈味物質。如丙氨酸和甘氨酸具有甜味，3 種支鏈氨基酸、賴氨酸、精氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸具有苦味，而蛋氨酸可影響食品肉樣的味道[24]。氨基酸含量的變化不僅影響梭子蟹的口感，更重要的是影響了梭子蟹的營養價值。同樣，甜菜堿、牛磺酸和葡萄糖水平的顯著下降不僅降低了肝胰腺的甜度，而且降低了肝胰腺的營養價值。此外，TMAO在肝胰腺中顯著降低，但其代謝產物三甲胺并沒有產生，從肝胰腺這一組織進一步說明梭子蟹在海水中冷藏4 d并未產生這些有害的胺類代謝物。與這些顯著降低的代謝物相反，肝胰腺中的乳酸水平在冷藏后期發生了顯著升高。在動物體內，乳酸由乳酸脫氫酶轉化丙酮酸后產生，這個反應通常在缺氧條件下發生，因此乳酸水平的升高表明肝胰腺組織在冷藏后期呈缺氧狀態，同時肝胰腺的口味開始呈現柔和的酸味。

3 結 論

本研究利用基于NMR的代謝組學技術，分析了冷藏對三疣梭子蟹肌肉和肝胰腺營養物質的影響。NMR技術共檢測到肌肉中的30 種物質和肝胰腺中的27 種物質。鮮活梭子蟹在4 ℃海水中冷藏保存，肌肉的營養物質變化主要發生在前2 d，而肝胰腺的營養物質變化主要發生在第1天。肌肉中主要變化的物質是ATP及其水解產物以及乳酸、?；撬?、TMAO、谷氨酸和谷氨酰胺。肝胰腺中主要變化的物質是一系列氨基酸、甜菜堿、?；撬?、葡萄糖、琥珀酸亞胺、TMAO、膽堿-O-硫酸和2-吡啶甲醇等。這些物質的變化顯著改變了梭子蟹的口味和營養價值，但4 d的海水冷藏仍然保證了梭子蟹的可食用性。本研究結果可為三疣梭子蟹的貯藏和質量評價提供參考。