螺旋藻全蛋白與家族分類

王 娜，向清豪，趙肖榮，李博生*，聶中良

隨著人口的增長和生活水平的提高，人們對蛋白需求也越來越大，蛋白質資源的緊缺已經成為世界關注的焦點。尋找和開發新的蛋白資源已經成為我國食品工業亟待解決的問題[1]。螺旋藻是人類最理想的蛋白源，其蛋白含量高達藻粉干質量的三分之二以上，且均屬于優質蛋白[2]。螺旋藻中必需氨基酸的組成與聯合國糧農組織規定的最佳氨基酸組成相吻合[3-4]。近年來，從藻細胞中分離出大量的蛋白類生物活性物質[5]，其具有抗氧化[6]、抗腫瘤[7]、免疫調節[8]等功能。由于螺旋藻具有極高的營養價值與獨特的保健功效而成為全球開發規模最大的經濟微藻之一[9]。

近年來，科研工作者對螺旋藻蛋白的功能及開發利用進行了大量的研究。目前，對于螺旋藻蛋白功能的研究主要集中在抗腫瘤、抗病毒、抗氧化和提高機體免疫力等方面[10]。螺旋藻的這些功能與其含有的活性蛋白有直接的關系，如藻膽蛋白[11-13]、超氧化物歧化酶[14]、金屬硫蛋白[15]、熱休克蛋白70[16]、絲氨酸蛋白酶抑制劑[17]均已得到開發并且產品已上市。還有一些活性蛋白處于研究階段，表現出較大應用價值，例如海藻糖合酶[18]和4-α-糖基轉移酶[19]。由此可知，螺旋藻蛋白開發潛力巨大。

目前，對于螺旋藻全蛋白及其分類的研究鮮見全面的分析研究報道。本實驗通過相對和絕對定量同位素標記（isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ）實驗和液相色譜-串聯質譜（liquid chromatography mass spectrometry，LC-MS/MS）技術對螺旋藻的全蛋白組進行測定；采用序列分類法對蛋白進行家族分類，根據同一家族或超家族具有序列一致性或者結構和功能相似性的特點[20-22]，將螺旋藻蛋白分成不同的蛋白家族或超家族，使序列相似性低但結構和功能具有同源性的不同蛋白家族歸到同一超家族，并對各超家族中的功能蛋白進行研究；通過對超家族中的已知蛋白開發利用現狀進行分析及未知蛋白功能進行推測，為進一步研究螺旋藻活性蛋白開闊視野，為螺旋藻的開發利用提供一定的參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鈍頂螺旋藻（Spirulina platensis）、螺旋藻凍干粉由北京林業大學螺旋藻研究所提供；胰蛋白酶美國Promega公司；乙腈 澳大利亞Merck公司；十二烷基磺酸鈉（sodium laurylsulfonate，SDS）、二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）、三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）、三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽（trihydroxymethyl aminomethane，Tris-HCl） 、TCA/丙酮提取液美國Sigma公司；尿素 美國Urea公司；三甲基碳酸氫鈉、碘乙酰胺、磷酸二氫鉀、氯化鉀 北京化學試劑公司。

1.2 儀器與設備

JAC-IV型超聲波細胞粉碎機 濟寧市奧波超聲波電氣有限公司；YXJ-2離心機 湘儀離心機儀器有限公司；LL-1500型真空冷凍干燥機 賽默飛世爾科技（中國）有限公司；iTRAQ Reagent-4plex Multiplex Kit（AB SCIEX）試劑盒 上海儲甜生物科技有限公司；C18Cartridges色譜柱（Empore? SPE Cartridges C18（標準密度），長度7 mm，容量3 mL） 美國Sigma公司；API 4000 LC-MS/MS聯用儀 美國AB SCIEX公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品的制備和保存

取適量螺旋藻凍干粉加入燒杯中，以1∶20的體積比加入蒸餾水配制螺旋藻懸浮液，超聲破碎（功率500 W，間隔1 min，超聲30 min，冰水浴）；破碎后離心（8 000 r/min，10 min），收集上清液；然后抽濾，以除去未沉淀的雜質，得到的濾液即為螺旋藻全蛋白溶液；最后將此溶液進行真空冷凍干燥，得到全蛋白干粉，于冰箱冷藏備用。

1.3.2 蛋白質的消化和同位素標記（iTRAQ）

取20 μg的蛋白加入到30 μL STD緩沖液（4% SDS，100 mmol/L DTT，150 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0）中，沸水浴5min，冷卻至室溫，加入200 μL UA緩沖液（8 mol/L尿素和150 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0）混勻，轉入30 kDa超濾離心管，14 000×g離心15 min；加入100 μL 0.05 mol/L碘乙酰胺暗處理20 min，然后在上述條件下離心10 min，用100 μL UA緩沖液清洗濾波器3 次，再加入100 μL DS緩沖液（50 mmol/L三甲基碳酸氫鈉，pH 8.5）與樣品反應10 min，以上過程重復2 次。最后，向濾波器中加入40 μL溶解了2 μg胰蛋白酶的DS緩沖液；將所有樣品在37 ℃的條件下放置過夜。通過離心來收集產生的肽段，濾波器繼續使用40 μL的DS緩沖液漂洗。選擇iTRAQ Reagent-4plex Multiplex Kit（AB SCIEX）試劑盒進行標記。

1.3.3 SCX分級

在進行LC-MS/MS分析之前，先通過強陽離子交換色譜（strong cation exchange chromatography，SCX）使用多重標記試劑對肽進行純化，將真空干燥的多肽，溶入強陽離子交換緩沖液A（10 mmol/L磷酸二氫鉀在25%的CAN中，pH 3.0）中，Polysulfoethyl柱（4.6 mm×100 mm，5 μm，200 μ），選定合適梯度的洗脫液（10 mmol/L磷酸二氫鉀，500 mmol/L氯化鉀在25%的乙腈中，pH 3.0），洗脫速率為1 mL/min。將洗脫下的多肽液用餾分收集器進行收集，用C18Cartridges色譜柱進行脫鹽，每一個樣品都進行真空濃縮，然后溶解在40 μL體積分數0.1% TCA中。所有樣品在進行LC-MS/MS分析前都貯存在-80 ℃保存。

1.3.4 LC-MS/MS分析

1.3.4.1 色譜條件

色譜柱：ChromXP C18（C18-CL，360 μm×0.5 mm，3 μm，120 μ）；上樣量：10 μL；流速：2 μL/min；流動相A液：2%乙腈-0.1%甲酸-98%水；流動相B液：98%乙腈-0.1%甲酸-2%水；線性洗脫梯度為0～100 min B液0%～50%，100～108 min B液50%～100%，108～120 min B液100%。

1.3.4.2 質譜條件

質譜系統：AB SCIEX TripleTOF 5600質譜；TOF MS/MS掃描分辨率：30 000；質荷比范圍：m/z 350～1 500；累積時間250 ms。

1.4 數據分析

LC-MS/MS得到的數據運用Proteinpilot Software 4.2直接查庫分析，本研究使用的數據庫為Uniprot.oscillat orial es. fasta（蛋白質序列共125 415 條），查庫使用ProteinPilot軟件版本為ProteinPilot? Software 4.2。相關參數：樣品類型是iTRAQ 4-plex（標記肽），使用碘乙酰胺做為半胱氨酸烷基化試劑，用胰蛋白酶進行消化處理，選用的檢測設備為三重四極桿飛行質譜，分析過程無特例，自動進行偏移修正，進行全搜索，置信度大于0.05。ProteinPilot結果過濾參數為蛋白錯誤率不大于0.01。

2 結果與分析

2.1 螺旋藻蛋白序列比對（BLAST）

通過ProteinPilot軟件處理和UniProtKB數據庫（版本號：Release_201407）搜索，發現在螺旋藻中共存在2 085 個蛋白質。每個蛋白分子在SCOP數據庫中進行檢索，能夠得到蛋白質所處的蛋白家族。再利用一款本地化的序列對比軟件NCBI BLAST＋（ncbi-blast-2.2.28＋-win32.ext）將由軟件鑒定到的螺旋藻蛋白質與NCBI nr數據庫中的相應蛋白質序列進行對比，序列比對結果如圖1所示。

圖1 序列比對相似性分布Fig. 1 Sequence similarity distribution

由圖1可見，分析所得的比對相似性范圍為38%～100%，絕大部分的目標蛋白的序列比對相似性可超過90%。說明所采用的序列分類法可信度高。

2.2 螺旋藻細胞蛋白組成及分類

由圖2可見，螺旋藻中已知蛋白有1 562 個，占總蛋白種類的75%左右；未知蛋白有523 個，占總蛋白種類的25%以上；按照序列分類法歸入蛋白家族的有869 個，占總蛋白種類的42%，其中已知蛋白有763 個，未知蛋白有106 個；未歸入蛋白家族的有1 216 個，占總蛋白種類的58%，其中已知蛋白有799 個，未知蛋白有417 個。869 個可分類蛋白中已知蛋白與未知蛋白比例約為7∶1，雖然已知蛋白結構和功能已明確，但實際得到開發并應用的卻很少，對未知蛋白功能的研究更是微乎其微。通過家族分類將螺旋藻蛋白分為7大超家族，進而為分析超家族中已知活性蛋白的開發現狀和推測未知蛋白的功能指明方向。

圖2 螺旋藻蛋白質組的分類Fig. 2 Classification of Spirulina proteome

2.3 螺旋藻蛋白質超家族及其功能分析

2.3.1 糖苷酶超家族

糖苷酶超家族成員是由α-螺旋折疊構成的三維結構。具有相同三維結構的不同蛋白，其氨基酸序列相似性較低。糖苷酶超家族在自然界物質循環和能量循環中扮演極其重要的角色[23]，如4-α-糖基轉移酶和海藻糖合酶。來自于其他生物中的這2 種蛋白酶在抗氧化、改善淀粉結構和作為生物分子保護劑等[24-26]方面已得到應用，但存在于螺旋藻中的這些酶尚未得到開發。

表1 糖苷酶超家族Table 1 Trans glycosidases superfamily

由表1可知，有14 個蛋白屬于糖苷酶超家族，已知蛋白有11 個。其中有兩種蛋白基因名稱相同為malQ，均來源于Arthrospira sp. PCC 8005，它們都由一個結構域組成，大小分別為530 個和503 個氨基酸，其功能具有相似性，都能把1,4-α-D-葡聚糖的一個片段轉移到受體的新位置上，并能保持4-α-葡聚糖轉移酶的活性；4-α-葡聚糖轉移酶蛋白來源于Arthrospira platensis C1，由一個結構域組成，其大小為505 個氨基酸，也具有上述功能，通過Uniprot數據庫對該蛋白功能搜索，根據相似功能域推斷該蛋白可能具有不需要任何輔酶或輔助因子就能催化糖苷鍵水解的活性；而其他8 個已知蛋白都是由一個結構域組成且都能參與碳水化合物代謝過程。該超家族中有3 個未知蛋白，它們序列相似性低且蛋白序列結構尚未被認識，既然處于同一超家族，那么未知蛋白與已知蛋白具有相似于碳水化合物代謝區域。

2.3.2 球蛋白超家族

通過數據庫的檢索，發現藻藍蛋白通過分類歸入了球蛋白超家族。藻藍蛋白是目前螺旋藻球蛋白超家族中研究最多的一種蛋白。大量的臨床研究表明，藻藍蛋白具有抗腫瘤、抗輻射、調節免疫力、清除自由基、促進細胞生長等生理作用[27]。

表2 球蛋白超家族Table 2 Globin-like superfamily

由表2可知，有11 個蛋白歸入球蛋白超家族。其中命名為cpcB的兩種蛋白在該家族中氨基酸序列一致性高達93%，都為晶體結構，均來源于Spirulina fusiformis；命名為N/A的兩種蛋白序列相似性高分別為80%和99%，其晶體結構為α亞基和β亞基，它們靠靜電相互作用形成有部分重疊的“彎月形”單體，3 個單體圍繞中心軸形成一個具有中央空洞的圓盤形三聚體，這兩種蛋白都屬于藻膽蛋白家族，該家族蛋白β亞基的72 位均為經過修飾的γ-N-甲酰天冬酰胺殘基，且在某位點處的氨基酸殘基相當保守，并且認為這些位點在保證色基的構象以及蛋白質分子穩定性方面具有重要的意義；cpcB1序列一致性為77%，有兩個結構域，具有參與色素形成的功能；而另外的6 個蛋白序列一致性很低，但結構相似性卻很高，都能夠參與光合作用。不同蛋白功能的改變來源于一些特定部位氨基酸的差異，該研究為今后深入探討球蛋白超家族中各蛋白結構、性質與功能的關系的研究提供參考依據。

2.3.3 熱休克蛋白70 kDa（HSP70）超家族

HSP70超家族中所有成員都含有ATP酶區和多肽結合區組成的共同的結構。ATP酶區位于蛋白的N端，包括385 個氨基酸殘基，分子質量為44 kDa，此區域高度保守，具有水解ATP的活性。多肽結合區位于蛋白的C端，分子質量約27 kDa，由底物結合域和可變動功能域組成，具有結合未折疊多肽的功能特點。HSP70大約由650 個氨基酸組成，是一組進化上高度保守的應激蛋白，而螺旋藻的生長環境中鹽堿含量較高，這為分析應激性蛋白的表達和含量的變化提供新的研究領域[28]。

表3 熱休克蛋白70 kDa（HSP70）超家族Table 3 Heat shock protein 70 kDa (HSP70) superfamily

由表3可知，在螺旋藻內有4 個蛋白屬于HSP70超家族，且全為已知蛋白，它們序列相似性極低。其中編號為K1WRN2的蛋白序列一致性為11%，其余3種蛋白序列相差很大。編號為K1W408和K1WRN2的兩種蛋白均來自A. platensis C1，且屬于HSP70家族，該家族蛋白具有功能相關性，其三維結構是由α-螺旋組成的區域，具有高度保守鈣調素結合結構域，其大小為45 kDa，具有較高的ATP親和性且氨基端具有弱的ATP酶活性，該家族在機體免疫反應中十分重要，具有抗原載體和免疫佐劑作用，成為重組核酸疫苗理想的免疫增強因子，在核酸疫苗研制方面引起了科研人員的重視。

2.3.4 枯草桿菌蛋白酶超家族

表4 枯草桿菌蛋白酶超家族Table 4 Subtilisin-like superfamily

枯草桿菌蛋白酶是一類分子質量低于14 kDa的一種堿性蛋白酶，大部分枯草桿菌蛋白酶是由270多個氨基酸殘基組成[29]，具有良好的耐高溫、耐膽鹽的能力，環境適應能力強[30]，在螺旋藻中廣有分布；其酶解能力也很強，能水解蛋白成小分子肽，目前洗滌劑中酶量的90%為枯草桿菌蛋白酶[29]。螺旋藻作為一種天然綠色的原料，還沒有相關此類的報道。因此，對該家族進行多方面的工程研究，具有一定商業價值。

由表4可知，螺旋藻中歸入枯草桿菌蛋白酶超家族的蛋白共有8 個，且全為已知蛋白。AmaxDRAFT_0723在該家族中序列一致性為39%，它有兩個結構域，其大小分別為270～593 個和653～738 個氨基酸。值得注意的是K1WF48和K1X3Z6這兩種蛋白在該家族中序列相似性高達70%，均來自A. platensis C1，其中編號為K1WF48的蛋白具有一個結構域，其大小為18～258 個氨基酸；編號為K1X3Z6的蛋白具有兩個結構域，其大小分別為277～467 個和654～885 個氨基酸。這些蛋白在各自的結構域都具有相似的分子功能，能夠降低絲氨酸型內肽酶的活性，而內肽酶的活性增強導致植物衰老過程中蛋白質含量降低[31]，因此該家族可能在延緩生物體衰老方面具有重要意義。

2.3.5 硫氧還蛋白超家族

硫氧還蛋白（Trx）超家族中所有蛋白分子質量都在12 kDa左右，大都具有-Cys-Gly-Pro-Cys-（-CGPC-）的活性中心位點。活性位點中兩個半胱氨酸巰基能夠可逆地形成二硫鍵，使Trx具有氧化態和還原態兩種存在形式，參與氧化還原反應。該超家族蛋白在結構上具有高度的相似性，具有極其牢固的三級結構，其分子內75%以上的氨基酸殘基在空間上形成了互相交錯的5 個β-折疊與4 個α-螺旋，這些連續的二級結構構成了整個分子的核心。Trx作為一類廣泛存在的熱穩定的氫載體蛋白質，在以光合作用為生命動力的螺旋藻中有著重要的作用[32]。

表5 硫氧還蛋白超家族Table 5 Thioredoxin-like superfamily

由表5可知，有18 個蛋白歸入硫氧還蛋白超家族，且全為已知蛋白。其中超過1/2的蛋白序列一致性低于30%，但它們結構具有很高的同源性，都具有抗氧化活性和保持氧化還原酶活性，并能維持細胞氧化還原的穩態。另外在該超家族中還有少數幾種蛋白序列一致性相對較高，它們均來自A. platensis C1，例如編號為K1VW14蛋白序列一致性為50%，有一個結構域，其大小為3～152 個氨基酸；K1W397序列一致性為68%，具有一個結構域，其大小為8～104 個氨基酸，還可以作為電子載體。細胞中的活性氧是導致生物氧化脅迫的一個主要方面，Trx可以通過對細胞內被氧化的二硫鍵的還原來修復機體的氧化損傷，并通過這種方式防止機體衰老。然而，Trx消除活性氧與抑制機體衰老的分子機理仍然沒有得到完全的闡明，因此該超家族為研究機體衰老提供了一條新思路。

2.3.6 核酸結合蛋白超家族

核酸結合蛋白是與核酸結合的蛋白質，其分子質量為19 kDa，負責DNA分子遺傳信息的復制和表達，這類蛋白對螺旋藻的繁殖和相關特性遺傳有著重要作用[33]。

表6 核酸結合蛋白超家族Table 6 Nucleic acid-binding proteins superfamily

由表6可知，共有21 個已知蛋白歸入核酸結合蛋白超家族。該超家族蛋白具有相似的結構域，都能與核酸結合并參與DNA的復制。PheT序列一致性為31%，具有3 個結構域，其大小分別為39～150、412～502、723～816 個氨基酸，屬于苯丙氨酰-tRNA合成酶β亞家族，1型亞科；Rps蛋白的序列同源性很高，有83%序列相似性；其他19 個蛋白序列一致性都低于30%；另外編號為K1WHW6、K1WP28和H1WGP9這3 種蛋白都由一個結構域組成且參與RNA結合；編號為K1WPZ1和K1XDJ8這兩種蛋白還參與翻譯的過程。由此可見，該超家族對生物體中生命活動具有重要意義。

2.3.7 限制性內切酶超家族

通過序列分類法，發現螺旋藻蛋白中的限制性內切酶超家族，該超家族的特點是相對分子質量較小，通常在2×104～10×104之間，一般由2 個或4 個相同亞基所組成。限制性內切酶能識別DNA的特異序列，并在識別位點或其周圍切割雙鏈DNA，因此，該蛋白超家族的研究會對螺旋藻基因表達具有重要意義。

表7 限制性內切酶超家族Table 7 Restriction endonuclease-like superfamily

由表7可知，共有22 個蛋白歸入限制性內切酶超家族，僅有1 個已知蛋白。推定的FdxN元件切除控制因子蛋白來自Arthrospira sp. PCC 8005，序列相似性低，但氨基酸序列完整，結構域只有一個，由138 個氨基酸組成，在該結構域中具有維持核酸酶活性并與核酸結合的功能。其余21 個蛋白都為未知蛋白，也應具有類似已知蛋白的功能。研究表明，某些基因的擴增可能與細胞的惡性轉化有關[34]。該超家族有望在腫瘤細胞遺傳學領域發揮作用，因此擁有21 個未知蛋白的該蛋白超家族具有一定研究價值。

3 結 論

螺旋藻蛋白種類繁多、結構各異、功能奇特，因此從全蛋白角度進行家族分類十分必要。對螺旋藻內的全蛋白測定和蛋白質家族分類，得到螺旋藻內共含有2 085 個蛋白，基于SCOP蛋白分類數據庫按照序列分類法最終能按照蛋白質家族（超家族）分類的蛋白有869 個，剩下的1 216 個蛋白質則不能按照該法歸入家族。將869 個可分類蛋白共分成233 個蛋白超家族和87 個蛋白家族，其中可分類蛋白中有106 個未知蛋白歸入了41 個不同的蛋白超家族。但未能歸入家族的蛋白含量占總蛋白含量的一半左右，而這些未知的功能蛋白同樣存在潛在的開發價值，以待開發。

螺旋藻蛋白超家族共分為7 大類。1）來自于螺旋藻糖苷酶超家族中已知蛋白有11 個，其中α-淀粉酶在食品改良方面已被利用，而其余的10 個已知蛋白中的4-α-糖基轉移酶可用于制備大環糊精和糖原，開發潛力巨大；海藻糖合酶可作為生物分子保護劑，海藻糖的工業生產最初是通過微生物發酵或直接從干酵母中提取，生產成本太高，已逐漸被酶法合成所取代，而螺旋藻可以作為海藻糖合酶的新來源。另外，該超家族還有3 個未知蛋白，其與已知蛋白有功能同源性，也應及時對它們展開研究。2）球蛋白超家族共包括11 個已知蛋白，其中有8 個蛋白屬于藻膽蛋白，它們在天然食品色素、醫藥保健、生物制劑等方面被廣泛應用。該超家族蛋白在螺旋藻中的含量豐富且開發利用價值極高。3）HSP70超家族中包括4 個已知蛋白，其中分子伴侶DnaK是一種環境脅迫相關蛋白，當細胞受到多種環境脅迫時，DnaK起著重要作用，在螺旋藻中已經得到開發利用，Hsp70-肽疫苗主要參與的是細胞免疫，能有效激活CTL，可以作為治療性疫苗，這是與普通疫苗的最大區別。在疫苗研制方面具有廣闊的臨床應用前景。4）枯草桿菌蛋白酶超家族共包括8 個已知蛋白，其中較為重要的是具有抑制血栓形成的枯草桿菌蛋白酶，而另外7 個已知蛋白中類枯草桿菌蛋白酶能夠在降低絲氨酸型內肽酶的活性、延緩植物衰老方面有利用價值，值得深入開發研究。5）螺旋藻中還有4 個蛋白超家族，包括硫氧還蛋白超家族、核酸結合蛋白超家族、環核苷三磷酸水解酶超家族和限制性內切酶超家族。它們在食品、醫藥、化妝品等方面也具有很大的開發潛能。其中值得研究的是限制性內切酶超家族，該超家族22 個蛋白中僅有1 個已知蛋白在腫瘤治療的醫學領域中發揮重要作用，因此擁有21 個未知蛋白的該超家族具有極大的開發應用價值。綜上所述，螺旋藻蛋白含量高、蛋白種類豐富。對螺旋藻蛋白質進行家族分類研究，根據結構和功能同源性將已得到應用的活性蛋白分為不同的家族或超家族。結果顯示還有近一半的活性蛋白未被認識和歸類，這些活性蛋白具有極高的研究價值。本研究為進一步探討螺旋藻蛋白活性，蛋白組學的研究提供了新思路，也為螺旋藻資源的開發利用提供一定的參考。