姜黃素對大鼠環孢素A腎間質纖維化的保護作用

王潤秀 汪國平 曹春瑜 李偉松 謝富華

[摘要]目的 探討姜黃素（Cur）對環孢素A（CsA）而致的大鼠腎間質纖維化的保護作用及其可能的分子機制。方法 將18只SD大鼠隨機分為對照組（Ctrl組，n=6）、CsA組（n=6）和CsA+Cur組（n=6），分別給予橄欖油、CsA、CsA聯合Cur處理。通過測量大鼠的體重、取血測尿素氮和肌酐、腎組織病理學檢查等指標觀察Cur對動物腎間質纖維化的改善作用。通過檢測大鼠腎組織超氧化物歧化酶（SOD）活性及丙二醛（MDA）含量反映其ROS水平。采用分子生物學方法檢測腎組織轉化生長因子-β（TGF-β）的表達情況。結果 CsA組動物相對于Ctrl組，體重下降（P<0.05），血尿素氮和肌酐水平顯著上升（P<0.05），腎組織TGF-β表達上調（P<0.05），ROS水平上升，病理學表現為輕度間質纖維化，但同時給予Cur可以在一定程度上緩解上述表現。結論 Cur對CsA而致的大鼠腎間質纖維化具有一定的保護作用，其分子機制可能是降低體內ROS水平和下調TGF-β表達。

[關鍵詞]姜黃素；環孢素A；腎間質纖維化

[中圖分類號] R332 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2018）5（b）-0009-04

Protective effect of Curcumin on the renal interstitial fibrosis of rat by Cyclosporin A

WANG Run-xiu1 WANG Guo-ping1 CAO Chun-yu1 LI Wei-song2 XIE Fu-hua3

1.Department of Nephrology，the First Affiliated Hospital of Gannan Medical University，Jiangxi Province，Ganzhou 341000，China；2.Department of Pathology，the First Affiliated Hospital of Gannan Medical University，Jiangxi Province，Ganzhou 341000，China；3.Experimental Teaching Center for Analysis and Testing，Gannan Medical University，Jiangxi Province，Ganzhou 341000，China

[Abstract]Objective To investigate the protective effects of Curcumin （Cur） on the renal interstitial fibrosis induced by CsA and reveal the underlying molecular mechanisms.Methods 18 SD rats were randomly divided into control group （Ctrl group，n=6），CsA group （n=6） and group CsA+Cur group （n=6） and the above-mentioned groups was treated with olive oil，CsA and CsA combined with Cur respectively.The effect of Cur on renal interstitial fibrosis in rats were observed by measuring body weight，blood urea nitrogen and creatinine，and histopathological examination.The level of ROS was detected by detecting SOD activity and MDA content in rat kidney tissue.The expression of transforming growth factor beta （TGF-β） in renal tissue was detected by molecular biology.Results Compared with ctrl group，weights of rats in CsA group decreased obviously （P<0.05），and the level of blood urea nitrogen and creatinine increased significantly （P<0.05），and the expression of TGF-β increased significantly （P<0.05）.The level of ROS increased， and the pathological findings were mild interstitial fibrosis.However，giving Cur at the same time could alleviate the above symptoms to some extent.Conclusion Cur has a some protective effect on the renal interstitial fibrosis which induced by CsA，and its molecular mechanism may be down-regulating the expression of TGF-β and the level of ROS.

[Key words]Curcumin；Cyclosporin A；Renal interstitial fibrosis

環孢素A（CsA）在各種腎臟疾病如難治性腎病綜合征、自身免疫性疾病、各種器官移植或骨髓移植術后應用廣泛，它能顯著延緩慢性腎臟病的進展，改善患者的生活質量并延長生命[1-5]。然而，長期和廣泛使用CsA卻會所造成腎臟的慢性結構性損害即腎間質纖維化[6-7]。不過，近來有研究表明，從姜黃中提取的酚類物質姜黃素（curcumin，Cur）具有清除氧自由基（reactive oxygen species，ROS）、抗纖維化、抗細胞增殖和抗炎等作用，不僅對缺血再灌注腎損害、氧化應激誘導的腎損害等均具有很好的保護作用，而且長期應用無明顯毒副作用[8-10]。超氧化物歧化酶（SOD），廣泛存在于動植物組織細胞中，是重要的生物抗氧化系統。丙二醛（MDA）是生物體內氧自由基作用于脂質的代謝產物，檢測組織中SOD活性和MDA水平可間接反映其ROS水平的高低[11-12]。本研究探討Cur是否對CsA引起的腎間質纖維化具有保護作用及其可能的分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選取SD大鼠，共18只，購自贛南醫學院實驗動物中心，平均體重約300 g，雌雄各半，飼養于標準環境，自由進水進食。

1.2 藥品與試劑

橄欖油：Bellina蓓琳娜牌，購自普通超市。CsA膠囊：50 mg/粒，華北制藥股份有限公司，H10960008，以橄欖油稀釋成相應濃度灌胃給藥。姜黃素：國藥集團，DMSO助溶后以橄欖油稀釋成相應濃度灌胃給藥（DMSO濃度<0.2%）。SOD活性和MDA含量檢測試劑盒購自索來寶生物有限公司。RNA提取試劑Trizol購自天根生物科技有限公司。引物合成于上海生工生物工程有限公司。anti-TGF-β和anti-Actin抗體購自美國SantaCruze公司。

1.3 方法

1.3.1 實驗分組、藥物處理和指標檢測 18只SD大鼠購進并飼養1周后隨機分為3組：Ctrl組6只，以橄欖油 30 mg/（kg·d）連續灌胃 24 d；CsA組6只，以CSA 30 mg/（kg·d）連續灌胃24 d；CsA+Cur組6只，同時以CSA 30 mg/（kg·d）和姜黃素200 mg/（kg·d）連續灌胃24 d。每次給藥前對大鼠的體重進行稱量，并將每隔3 d的數據繪制成動物體重變化圖；給藥結束后1 d采集大鼠尾靜脈血清采用全自動生化分析儀測定血清尿素氮和肌酐水平。

1.3.2 腎組織病理學檢測 給藥結束后脫頸椎處死所有動物，將腎臟摘下后，去除包膜，長軸方向對切，取部分組織行4% 多聚甲醛固定，石蠟包埋切片，切片厚 4 μm。切片常規行常規染色，光鏡觀察。染色切片用高清晰度彩色醫學圖文分析系統進行分析。

1.3.3大鼠腎組織SOD活性及MDA含量檢測 稱取適量大鼠腎組織，按每0.1 g加1 ml組織提取液制成組織勻漿，測定組織蛋白濃度（Cpr）后嚴格按照各試劑盒說明書的方法進行黃嘌呤氧化酶法測定組織SOD活性，硫代巴比妥酸法測定組織MDA含量。按下列公式計算組織SOD活性和MDA含量：SOD活性（U/mg prot）=11.11×稀釋倍數×[（A560空白管-A560測定管）/A560測定管]÷Cpr；MDA含量（nmol/mg prot）=25.8×（A532-A600）÷Cpr。

1.3.4大鼠腎組織分子生物學檢測 用藥結束后，各取部分腎組織剪成2小份，液氮速凍。其中1份采用Trizol法提取組織RNA，逆轉錄后行實時定量PCR檢測轉化生長因子-β（TGF-β）mRNA表達情況，TGF-β上下游引物序列分別為5′-GTAACGGAGTGGTGCGCCAA-3′和5′-TTGCACTTCATCCGCGTCTAGA-3′；以GAPDH作為內參基因，其上下游引物序列分別為5′-GGGTGTGAACCATGAGAAGT-3′和5′-CCAAAG TTGTCATGGATGACCT- 3′。另一份稱重后加液氮在冰上研磨成粉末，加入RIPA裂解液（含cocktail）冰上裂解30 min，4℃ 12 000 r/min，離心10 min，取上清100℃變性10 min，各組任選2個樣品蛋白經十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），轉膜，脫脂牛奶封閉，4℃孵育抗體過夜，洗膜后孵育二抗，增強化學發光（enhanced chemilumine-scence，ECl）顯色曝光。

1.4 統計學方法

為減小觀察誤差，采用3次測量取平均值作為最終觀測值的方法。數據采用SPSS 19.0軟件包進行統計學分析，計量資料采用單因素方差分析（one-way ANOVA），并用SNK法進行兩兩比較，檢驗水準（α）=0.05。

2 結果

2.1 Cur對大鼠體重和腎功能的影響

2.1.1體重的變化 CsA組大鼠在使用CsA后第4天開始直至給藥結束期間，其體重相對于Ctrl組和CsA+Cur組均有所下降，且差異有統計學意義（P<0.05），但CsA+Cur組大鼠的體重變化相對于正常組，差異無統計學意義（P>0.05）（圖1）。

2.1.2血尿素氮和肌酐的變化 給藥結束后，CsA組大鼠的尿素氮和血肌酐相對于Ctrl組和CsA+Cur組顯著上升，且差異均有統計學意義（P<0.05），而CsA+Cur組大鼠的尿素氮和血肌酐相對于正常組，差異無統計學意義（P>0.05）（表1）。

2.2 大鼠腎臟組織病理學變化

Ctrl組大鼠腎組織結構正常，CsA組可見腎小球毛細血管袢開放減少，近曲小管上皮細胞細胞水腫，偶可見空泡變性和溶解，壞死，小管輕度萎縮。間質單個核細胞散在或灶性浸潤，有輕度腎間質纖維化。而應用姜黃素保護組即CsA+Cur組的上述病變均有所減輕。

2.3 大鼠腎組織SOD活性及MDA含量

與Ctrl組比較，CsA組的大鼠腎臟組織中SOD活性下降和MDA水平升高，即組織中ROS水平升高（P<0.05），而給予Cur可降低動物腎組織中的ROS水平（表2）。

2.4 大鼠腎組織TGF-β表達的檢測

CsA組大鼠腎組織TGF-β mRNA表達量相對于Ctrl組和CsA+Cur組顯著上升，且差異有統計學意義（P<0.05），而CsA+Cur組大鼠腎組織TGF-β mRNA表達量相對于正常組，差異無統計學意義（P>0.05）（圖2）。

免疫印跡結果：CsA組大鼠腎組織TGF-β 蛋白表達量相對于Ctrl組和CsA+Cur組顯著上升，且差異有統計學意義（P<0.05），而CsA+Cur組大鼠腎組織TGF-β 蛋白表達量相對于正常組，差異無統計學意義有（P>0.05）（圖3）。結果表明：蛋白水平的變化與上述mRNA水平的變化基本吻合。

3討論

CsA 導致慢性腎纖維化發生的因素較多，其發生機制也較復雜。①CsA可直接或間接促進促纖維化因子如TGF-β[13-14]、活性ROS[15-16]、血管內皮生長因子（VEGF）[17]、單核細胞超化蛋白-1（MCP-1）[18]和骨橋蛋白（OPN）[19]等的表達上調。②CsA可激活腎素-血管緊張素系統（RAS），從而改變腎臟血液動力學[20]。③腎小管上皮細胞轉分化（EMT）及內皮素的產生過多、Toll 樣受體（TLR）及上皮細胞鈉通道異常等因素也參與了CsA 慢性腎纖維化的發生[5，15，21]。

然而，在上述眾多因素中，TGF-β和ROS扮演了非常重要的角色。TGF-β是最強的致纖維化因子之一，在組織器官纖維化過程中有重要作用。TGF-β主要通過 Smad 信號通路發揮生物學效應：促進膠原以及纖維連接蛋白、層黏蛋白等的表達，導致細胞外基質（ECM）的大量產生[13，22]；降低金屬蛋白酶表達，抑制 ECM 降解；激活炎癥反應，加重腎臟損害；促進EMT的發生，后者可以大量合成ECM。CsA的長期使用還可引起腎血管病變導致腎組織灌注不足，缺氧缺血誘導ROS的產生。反過來，產生的ROS又加重了腎小管上皮細胞的損傷，使其表型改變，發生EMT或凋亡。

Cur是中藥姜黃中提取的一種酚類物質，已有研究表明，Cur對缺血再灌注腎損害、糖尿病腎病、氧化應激誘導的腎損害、阿霉素所致的腎損害等均具有保護作用，不僅具有清除ROS、抗纖維化、抗細胞增殖、抗炎等性質，而且長期應用無明顯毒副作用。近來有學者發現，Cur能使單側輸尿管梗阻大鼠的TGF-β表達明顯減低，能刺激保護胞內酶途徑ROS的生成及可上調內皮細胞的ROS的水平，從而具有抗氧化特性。

本研究表明，應用CsA可導致動物體重下降，腎功能減低，腎臟輕度間質纖維化。進一步通過研究發現CsA導致腎臟纖維化與TGF-β表達上調和ROS水平升高有關，這與國內外的研究結果一致。Cur的聯合使用則可改善動物的機體狀態、保護腎功能和改善腎組織纖維化程度，其可能的分子機制是通過下調 TGF-β表達和降低體內的ROS水平實現的，但具體的信號通路有待進一步研究。

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（收稿日期：2018-03-08 本文編輯：許俊琴）