蜂蜜中氯霉素分析方法的研究概況及展望

余志清

摘 要：氯霉素作為違禁藥品，其殘留物在蜂蜜中的檢出顯示出不良商家在養(yǎng)殖過程中存在不同程度的濫用。為了能對其殘留量準(zhǔn)確分析，從而將此類情況嚴(yán)格控制在源頭，國內(nèi)外都有不同的分析方法。本文主要對目前運(yùn)用較多的酶聯(lián)免疫法、氣相色譜法、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、液相色譜法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、中性解吸-電噴霧萃取電離質(zhì)譜法、分子印跡法、膠體金免疫層析法、電化學(xué)法進(jìn)行概述，并分析不同方法的優(yōu)缺點(diǎn)，從而對蜂蜜中氯霉素殘留量的檢測方法進(jìn)行展望。

關(guān)鍵詞：氯霉素；蜂蜜；分析方法

中圖分類號：S896.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1671-2064（2018）13-0224-02

中國是蜂蜜生產(chǎn)及出口大國，據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國蜂蜜2017年11月份出口量約為1100萬千克，出口金額約為2300萬美元。歐盟是世界上重要的蜂蜜進(jìn)口地區(qū)，而我國是蜂蜜出口的主要市場之一，自2006年來歐盟食品和飼料預(yù)警系統(tǒng)RAAFF中有關(guān)從中國進(jìn)口蜂蜜的通報(bào)有31例，其中90%以上是由抗生素殘留超標(biāo)引起的[1]。我國目前已出臺相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)對蜂蜜中氯霉素的殘留進(jìn)行限定，其中農(nóng)業(yè)部第235號公告明確規(guī)定氯霉素為禁用藥物。氯霉素（Chloramphenicol，CAP）又稱氯胺苯醇或做霉素。主要成分是由委內(nèi)瑞拉鏈霉菌產(chǎn)生的代謝物，商業(yè)制劑為白色針狀或微帶黃綠色的針狀、長片狀結(jié)晶或結(jié)晶性粉末，味苦。長期使用可引起視神經(jīng)炎、共濟(jì)失調(diào)以及由于菌群失調(diào)而致的微生物素缺乏等不良反應(yīng)。兒童應(yīng)用本品，可引起循環(huán)衰竭、貧血、出血傾向和反復(fù)感染，甚至誘發(fā)再生障礙性貧血[2]。而養(yǎng)蜂過程中濫用氯霉素預(yù)防或治療蜂蜜疾病是我國蜂蜜氯霉素含量超標(biāo)的主要原因，且其殘留對蜂蜜品質(zhì)的影響是長期的。因此，通過進(jìn)一步加強(qiáng)“從養(yǎng)蜂到餐桌”全程的獸藥殘留監(jiān)控，才能保證我國蜂蜜的品質(zhì)，從而減少對我國蜂蜜出口的影響。

從目前我國蜂蜜中氯霉素殘留量檢測方法的現(xiàn)狀來看，主要分為酶聯(lián)免疫法、氣相色譜法、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、液相色譜法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，同時(shí)包括中性解吸-電噴霧萃取電離質(zhì)譜法、分子印跡法、膠體金免疫層析法、電化學(xué)法。

1 酶聯(lián)免疫法

目前，現(xiàn)行有效的國家標(biāo)準(zhǔn)中有2個(gè)酶聯(lián)免疫法針對蜂蜜中氯霉素的檢測，均基于抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行競爭性抑制測定，且在450nm處測定吸光度，根據(jù)吸光度值得出樣品中氯霉素的殘留量。

同時(shí)，劉姚等[3]以抗氯霉素單克隆抗體為包被原，氯霉素-辣根過氧化物偶聯(lián)物為標(biāo)記物，TMB作顯色底物，對標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液、包被溫度、包被抗體稀釋倍數(shù)等六個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化，建立了曲線方程式為y=-17.425x+97.509的直接競爭ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線，相關(guān)系數(shù)為R2=0.9913，且蜂蜜樣品的檢測限和定量限分別為0.15ng/g和0.33ng/g，添加回收率在97.58%～100.94%之間，批內(nèi)變異系數(shù)和批間變異系數(shù)均小于11%；另外整個(gè)檢測反應(yīng)過程耗時(shí)約為40min。表明該方法具有高精確度高穩(wěn)定性。

2 氣相氣質(zhì)法

由于氯霉素均含有電子親和性強(qiáng)的化學(xué)基團(tuán)，這使得利用氣相色譜-電子俘獲檢測法對蜂蜜中的氯霉素進(jìn)行檢測成為可能。目前常用的氣質(zhì)檢測方法通常采用GB/T 18932.20 -2003和農(nóng)業(yè)部781號公告-10-2006，均采用水溶解蜂蜜試樣，并用乙酸乙酯提取，將提取液濃縮后再用水溶解，經(jīng)固相萃取柱凈化、洗脫、氮吹后，用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行測定，外標(biāo)法進(jìn)行定量。

3 液相液質(zhì)法

液相色譜及液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀是目前檢測蜂蜜中氯霉素較為成熟且回收率基質(zhì)干擾較少的一種快速檢測方法。吳華等[4]建立了高效液相色譜檢測蜂蜜中氯霉素殘留的方法。樣品先用NaOH進(jìn)行堿化，經(jīng)高速離心沉淀大部份有機(jī)酸、極性雜質(zhì)，再用乙酸乙酯提取氯霉素。提取物在流動(dòng)相甲醇∶0.2%磷酸氫二銨緩沖液=40∶60的條件下，在波長278nm處測定氯霉素。該方法最低檢出濃度為0.01μg/g，在0.1～10μg/mL范圍內(nèi)，線性方程為y=60.404x+2.5945，相關(guān)系數(shù)R2=0.9993。加樣回收率為82.9%～86.7%，RSD為5.1%～6.0%。

馮雷等[5]則研究一種針對蜂蜜中氯霉素殘留量的液質(zhì)聯(lián)用分析方法。采用水溶解蜂蜜，用乙酸乙酯萃取蜂蜜水溶液中的氯霉素，氮吹至干后用水溶解樣品殘?jiān)缓笥肏LB小柱進(jìn)行固相萃取，對樣品中的氯霉素進(jìn)行凈化前處理。以乙腈-水作為流動(dòng)相，C18色譜柱對蜂蜜的氯霉素進(jìn)行分離，然后用電噴霧質(zhì)譜負(fù)離子多反應(yīng)監(jiān)測模式對氯霉素進(jìn)行檢測，縮短了色譜分離時(shí)間，提高了檢測靈敏度和分析結(jié)果可靠性，具有準(zhǔn)確、快速以及高靈敏度和高選擇性的特點(diǎn)，能夠適應(yīng)大規(guī)模樣品的快速分析要求。

胡曉慧等[6]采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)建立快速痕量檢測蜂蜜中氯霉素的方法。該方法以氘代氯霉素（D5-氯霉素）為內(nèi)標(biāo)，在超聲波輔助下，樣品用乙酸乙酯進(jìn)行堿性提取、凈化后，以乙腈-水為流動(dòng)相，并在電噴霧離子源負(fù)離子模式下進(jìn)行多反應(yīng)監(jiān)測，實(shí)現(xiàn)對氯霉素的定性、定量分析，分析時(shí)間為8min。在檢測范圍為0.1～20μg/mL內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)大于0.9990。當(dāng)添加水平分別為0.20、0.50、5.0μg時(shí)，氯霉素的加標(biāo)回收率為84.0%～104.2%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.95%～5.04%。方法檢出限為0.013μg/kg，定量限為0.025μg/kg。從而建立的方法快速高效，樣品前處理簡單，選擇性好，靈敏度高，適用于蜂蜜中氯霉素殘留的痕量檢測。

4 中性解吸-電噴霧萃取電離質(zhì)譜法

中性解吸-電噴霧萃取電離質(zhì)譜技術(shù)是利用斜對放置的進(jìn)氣管和樣品管提取和凈化待測樣品，再將樣品流引入電噴霧萃取電離源，帶電液與樣品液滴進(jìn)行碰撞融合，發(fā)生液液萃取和電荷轉(zhuǎn)移進(jìn)而達(dá)到去溶劑的效果，最終對待測物進(jìn)行質(zhì)譜分析[7]。

劉星星等[8]利用自行研制的中性解吸-電噴霧萃取電離質(zhì)譜技術(shù)建立了在無需樣品預(yù)處理的條件下，對蜂蜜中氯霉素快速直接檢測的方法。通過張茜等[9]對實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化，采用了用硝酸銀溶液（10mg/mL）為萃取劑，甲醇為中性解吸噴霧試劑，電噴霧萃取劑的流速為5μg/min，電噴霧電壓為4.5kV，離子源霧化氣的壓力為1MPa，離子源離子傳輸管的溫度為250℃，解吸氣所帶甲醇噴霧的流速為14μg/min的條件下，得到檢測蜂蜜中氯霉素的更佳方法。

5 分子印跡法

分子印跡技術(shù)是指當(dāng)模板分子（印跡分子或待測物）與聚合物單體接觸時(shí)會(huì)形成多重作用點(diǎn)，通過聚合過程這種作用就會(huì)被記憶，當(dāng)模板分子除去后，聚合物中就形成了與模板分子空間構(gòu)型相匹配的具有多重作用點(diǎn)的空穴，這樣的空穴將對模板分子及其類似物具有選擇識別特型[7]。基于分子印跡技術(shù)，陳海燕等[10]采用微波輔助法快速制備以氯霉素為模板分子的分子印跡聚合物。將合成的聚合物作為吸附劑，選擇性分離和富集蜂蜜樣品中的氯霉素，并結(jié)合高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對萃取物進(jìn)行分析。對合成的分子印跡聚合物進(jìn)行了表征，考察了聚合物的吸附性能及其選擇性，并進(jìn)行了Scatchard分析。結(jié)果表明，合成的聚合物為球形，對氯霉素具有良好的識別能力，最大表觀結(jié)合量可達(dá)0.428mmol/g。該方法的線性范圍為0.5～100ng/g，相關(guān)系數(shù)>0.999，蜂蜜中氯霉素的檢出限為0.13ng/g，6種蜂蜜樣品中氯霉素的加標(biāo)回收率范圍為88%～93%。得到了一種低檢出限、高回收率的快速分析方法。

6 膠體金免疫層析法

王元鳳等[11]通過肉眼觀測試紙條顯色情況、金標(biāo)圖像分析和ELISA試劑盒檢測回收率，并結(jié)合試劑條自身特性采用了回收率最高的處理方法對蜂蜜中氯霉素殘留檢測，即稱取4g試樣于15ml離心管中，加入2ml蒸餾水振蕩充分溶解。加入8ml乙酸乙酯，上下翻轉(zhuǎn)振蕩8min，靜置至上層有機(jī)相澄清，轉(zhuǎn)移5ml上層有機(jī)溶劑于5ml刻度冷凍管中，電吹風(fēng)吹干。加入160μlPBST緩沖液，溶解試管壁殘留，再加入1ml正己烷充分振蕩后靜置分層，吸取下層水相進(jìn)行待檢。結(jié)果表明，該分析方法具有選擇性好、靈敏度高的特點(diǎn)。

7 電化學(xué)法

張其美等[12]針對氯霉素建立了2種電化學(xué)檢測方法，并將其應(yīng)用于實(shí)際樣品檢測中，主要內(nèi)容如下：（1）通過多巴胺的自聚在玻碳電極表面修飾一層聚多巴胺膜，進(jìn)一步通過過氧化處理制得過氧化聚多巴胺膜修飾電極，并采用方波伏安法對蜂蜜中的氯霉素殘留進(jìn)行了測定。結(jié)果表明，玻碳電極在2mg/mL多巴胺溶液中自聚2.5h，并在0.5mol/L的NaOH溶液中過氧化處理后得到聚多巴胺膜修飾電極，在氯霉素溶液中采用SWV陰極掃描時(shí)具有最佳的出峰效果。峰電流與氯霉素的濃度3.0×10-6～1.1×10-3mol/L范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，檢出限為7.8×10-7mol/L。該修飾電極制備方法簡便易行、成本低、便于批量制備，用于檢測氯霉素操作簡單、選擇性好，適用于蜂蜜等食品樣品中氯霉素殘留的測定。（2）以氯霉素為模板分子，鄰苯二胺為功能單體，采用電化學(xué)聚合法在鉑微電極表面形成聚鄰苯二胺膜，經(jīng)洗脫液將模板分子洗脫，制得氯霉素分子印跡傳感器，并用于快速和選擇性檢測蜂蜜樣品中的氯霉素。該傳感器的響應(yīng)值與氯霉素的濃度在9.0×10-10～1.0×10-8mol/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，檢出限為3.9×10-10mol/L。運(yùn)用建立的方法對市售蜂蜜中的氯霉素進(jìn)行測定，并用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)進(jìn)行了方法驗(yàn)證。結(jié)果表明，該傳感器具有良好的選擇性和較高的靈敏度，便于實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場檢測和分析，具有很好的應(yīng)用前景。

8 綜述與展望

以上所述的氯霉素殘留物檢測方法中，酶聯(lián)免疫法具有方便、快速、易攜帶的優(yōu)點(diǎn)，適合氯霉素殘留物的初步篩選，較易出現(xiàn)假陽性的特點(diǎn)。近年來，液相色譜-三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀越來越多應(yīng)用于蜂蜜中氯霉素的檢測，具有高效、靈敏、準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，但由于其儀器價(jià)格不菲，一直未大范圍使用。而分子印跡、電化學(xué)方法的興起，必將有力推進(jìn)現(xiàn)場執(zhí)法的快速檢測，對政府部門的監(jiān)督起到一定的推動(dòng)作用，從而從源頭上控制住氯霉素的使用情況。

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