Survivin基因在胃癌癌前病變不同中醫證型中的表達

付兆媛 汪龍德 毛蘭芳

通過檢測胃癌癌前病變患者三種不同中醫證型（脾虛氣滯證、陰虛內熱證、胃絡瘀阻證）胃黏膜組織中抑癌基因Survivin的表達。探討中醫證型與Survivin表達之間的相關性。方法：實驗分為對照組和試驗組。對照組為24位健康體檢者的正常胃組織標本，試驗組為不同中醫證型組（脾胃虛弱證、陰虛內熱證、胃絡瘀阻證）。故共有4組（健康對照組、脾胃虛弱證組、陰虛內熱證組、胃絡瘀阻證組）；每位患者取新鮮胃黏膜6塊進行HE染色、免疫組化及RT-PCR。結果：Survivin基因陽性表達在脾虛氣滯證中有30.0%，陰虛內熱證中有38.3%，胃絡瘀阻證中有31.7%，健康對照組無表達；Ⅰ型腸化生無表達，Ⅱ型腸化生表達2.63%，Ⅲ型腸化生表達39.47%。異型增生表達10.53%。結論：胃黏膜組織凋亡相關基因Survivin基因的表達與胃癌癌前病變病理類型有關，而且在胃癌癌前病變不同中醫證型的表達有統計學意義?？蔀槲赴┌┣安∽兊闹嗅t證型客觀化提供依據。

胃癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，在各種惡性腫瘤中發病率排在第二位，在我國每年新增癌癥中位居第四位，是一個嚴重影響國人健康的公共衛生問題。而在甘肅省特別是武威地區胃癌的發生率又明顯高于全國水平，因此胃癌診治一直是我院消化內科研究的重點。國內外大多數學者認可的胃癌發病模式為：萎縮性胃炎一腸化生一異型增生一胃癌。眾所周知，目前醫學的發展對中晚期胃癌治療效果仍不理想，所以早診早治，是提高胃癌存活率的唯一有效措施。而對胃癌的早期診治主要依賴于對胃癌前期變化進行早期干預治療。胃癌癌前變化包括癌前狀態和癌前病變。癌前狀態為臨床概念，指胃癌前期疾病，如慢性萎縮性胃炎等。癌前病變（PLGC，Preca-ncerous lesions of gastric carcinoma）為病理概念，包括腸化生（Intestinal metap-lasia，IM）、不典型增生或稱異型增生（Dysplasia，Dys）?，F代醫學對PLGC的逆轉或阻斷效果不佳，中醫藥強調治未病、未病先防，針對其病因病機，運用辨證論治的特點，采用藥物、針灸、穴位貼敷等綜合治療，在改善臨床癥狀，改善和逆轉胃黏膜病變有顯著優勢。本研究旨在探討胃癌癌前病變患者中醫分型與Survivin表達的相關性，為臨床的辨證治療提供一定的幫助，并有可能為中醫規范化辨證治療提供具體的量化指標。

一、資料與方法

（一）一般情況

收集2015年1月至2016年12月甘肅中醫藥大學附屬醫院門診及住院PLGC患者120例，其中男性76例，女性44例，年齡36～76歲，平均年齡為56.48歲。其中年齡/>60歲33例，<60歲87例；門診健康體檢者24例作為對照組，其中男性15例，女性9例，平均年齡53.24歲，男女比例在性別年齡上無統計學意義（p>0.05）。

（二）診斷標準

1.西醫診斷標準：

（1）臨床表現：主要癥狀主要表現為非特異性消化不良，上腹部脹滿不適、疼痛；可伴有食欲不振、嘈雜、惡心、反酸、曖氣、口苦等癥狀，少數患者還可有乏力、消瘦、健忘、抑郁、焦慮等全身甚或精神癥狀。

（2）病理診斷標準：

腸腺化生：胃黏膜表層上皮細胞中出現分泌酸性黏液的杯狀細胞，有紋狀緣的吸收上皮細胞和潘氏（Paneth）細胞等。腸化生上皮有杯狀細胞和吸收上皮細胞者稱為完全化生，只有杯狀細胞者為不完全化生。不完全化生中又可根據其黏液組化反應，氧乙?；僖核彡栃哉邽榇竽c型不完全化生，陰性者則為小腸型不完全化生。不完全性大腸型化生與腸型胃癌的發生關系密切。

異型增生：指胃黏膜上皮和腺體的一類偏離正常分化，形態和機能上呈異型性表現的增生性病變?？砂l生在胃小凹上皮和腸化生處，具有較高的癌變傾向，但無間質侵犯。國際上通行的做法是分為低、高兩級別，高級別異性增生癌變率高。

2.中醫證型標準：

依據《中藥新藥臨床研究指導原則（試行）》，（1）脾胃虛弱證：胃痛隱隱，綿綿不休，時輕時重，喜溫喜按，空腹痛甚，得食則緩，乏力納差，舌淡苔白，脈細弱。兼有氣滯證：胃脘痞滿，嘔吐，惡心，暖氣等癥。（2）陰虛內熱證：胃脘隱隱灼痛，嘈雜，饑不欲食，煩渴思飲，口燥咽干，食少，大便秘結，舌紅少苔，脈細數或細弦。（3）胃絡瘀阻證：胃脘痛如針刺或刀割，痛處固定，拒按，舌質紫暗或瘀斑，脈澀。

（三）病例選擇標準

1納入標準

（1）符合西醫臨床診斷和病理診斷標準，經胃鏡檢查病理診斷為腸化生和不典型增生；（2）符合中醫證型診斷標準。中醫證型屬于脾胃虛弱證、陰虛內熱證、胃絡瘀阻證其中一種者；（3）受試者年齡在30～80歲之間；（4）無合并嚴重心腦血管疾病及全身器質性疾??；（5）向患者交代研究過程，取得同意簽署知情同意書。

2.排除標準

（1）心、肝、腎功能明顯異常；（2）急性胃炎、慢性胃炎（淺表性或者萎縮性無腸型化生及無異型增生的胃炎）、胃癌及轉移癌的患者；（3）中醫證型兩型并見無主次之分或三型并見證型復雜者；（4）資料不全或不完整者。

（四）實驗分組

本實驗分為對照組和試驗組，對照組為24位健康體檢者的正常胃組織標本，實驗組為不同中醫證型組（脾胃虛弱證、陰虛內熱證、胃絡瘀阻證）。

（五）實驗方法

與納入標準相符的患者簽署胃鏡檢查（取活檢）知情同意書，每位患者取胃體、胃竇和胃角的胃黏膜各2塊，組織用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋及切片，進行HE染色及免疫組化。

免疫組化法步驟：①取用4%多聚甲醛固定的胃黏膜組織進行石蠟包埋；②玻片撈取切片，恒溫箱60℃烤片過夜；③二甲苯及梯度酒精常規脫蠟至水；④0.01M枸櫞酸鹽緩沖液（PH6.0）熱修復抗原；⑤3%H2O2滅活；⑥滴加5%BSA封閉液孵育，滴加稀釋的一抗4℃過夜；⑦滴加二抗及SABC，37℃孵育15分鐘；⑧DAB顯色10分鐘，蘇木素復染5分鐘，鹽酸酒精脫分化；⑨脫水，透明，中性樹膠封片，顯微鏡觀察。病理醫師進行染色結果判斷，陽性反應判定標準：Survivin基因表達為胞漿中出現棕黃色顆粒為陽性顆粒，少部分也可見于細胞核，陽性細胞占10%以上為陽性表達，<10%為陰性。

RT-PCR技術步驟：①于一周內取-80℃儲存的胃黏膜組織提取RNA；②將RNA反轉錄DNA；③將酶、水、DNA中的目的基因、引物，依次加入PCR儀進行擴增；④跑膠：電泳儀中跑膠，檢測PCR產物。

引物序列及擴增條件

根據基因序列設計人Survivin引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

CCK引物序列：F：5′ATGGCC-GAGGCTGGCTTCATCCAC3′，R：5′TTGTAGTTTGTGCTATTCT-GTGAATTA3′，產物長度304bp，擴增條件：94℃ 5min，94℃ 30s，60℃30s，72℃60s，35個循環，72℃7min。

β-actin引物序列：F：5′AA-CACCCAGCCATGTACGTTG′，R：5′ CGGATGTCCACGTCA-CACTTCAT′，產物長度509bp。GAPDH退火溫度60℃，30個循環。

（六）統計學處理

所有數據均在SPSS19.0軟件包下進行分析，多組資料陽性率（%）的比較采用卡方檢驗（x2檢驗），并采用Bonferroni法進行組間多重比較分析，顯著性檢驗水準α=0.05，p<0.05差異具有統計學意義。

二、結果

（一）PLGC病理類型與中醫證型的關系

120例PLGC患者中醫分型脾胃虛弱證、陰虛內熱證、胃絡瘀阻證分別為36例，46例，38例，IM在脾虛氣滯證、陰虛有熱證、胃絡瘀阻證中分別有7例、9例、6例，Dys在脾虛氣滯證、陰虛有熱證、胃絡瘀阻證中分別有5例、10例、11例，而同時有IM和Dys分別有24例、27例、21例。IM、Dys、IM&Dys在各組間的比較無統計學意義，見表1。

（二）survivin在不同病理組織中的表達

Survivin基因在120例PLGC病例中陽性表達38例（31.67%），其中在腸腺化生中表達16例（42.11%），異型增生22例（57.89%），在Ⅰ型腸化生中無表達，Ⅱ型腸化生中表達1例（2.63%），Ⅲ型腸化生中15例（39.47%），異型增生輕度表達4例（10.53%），異型增生重度18例（47.37%）。Ⅲ型腸化生和重度不典型增生與其他組比較有顯著性差異（P<0.01），但兩組間比較無統計學意義（p>0.05），健康對照組、Ⅰ型腸化生、Ⅱ型腸化生、輕度不典型增生組間比較（p>0.05），無統計學意義（見表2）。

（三）Survivin在PLGC不同中醫證型胃黏膜的表達

1.免疫組化法SP法檢測Sur-vivin的表達

從表2可以看出，脾虛氣滯證、陰虛有熱證、胃絡瘀阻證胃黏膜survivin基因蛋白表達陽性者分別為4例（11.11%）、14例（30.43%）和20例（52.63%），脾虛氣滯證與對照組比較無明顯差異（p>0.05），陰虛有熱證較脾虛氣滯證和對照組明顯增高，差異有統計學意義（p<0.05）。而胃絡瘀阻證較脾虛氣滯證和對照組明顯增高，差異有統計學意義（p<0.01）。胃絡瘀阻證與陰虛內熱證比較，差異有統計學意義（p<0.05）（見表3）（附圖）。

2.RT-PCR技術檢測Survivin-的水平

由圖1、2示對照組、各證型組β-actin mRNA均有表達，而Sur-vivin mRNA在a、b道無表達，c、d道有表達，c、d與對照組Survivin mR-NA的表達有顯著性差異（p<0.01）。

三、討論

祖國醫學中并沒有“胃癌前期變化”這一病名，根據其胃脘痞滿、疼痛、食欲減退、曖氣、泛酸等臨床癥狀特征，可將其歸于中醫“胃痛”“痞證”等范疇。本病病位在胃脘，病變臟腑主要在脾胃，早在《內經》中對上述疾病的病因病機就有論述，其病因主要與飲食不節、嗜好煙酒、情志不節、郁思惱怒、素體虛弱、勞倦內傷、或用藥不當、久病體虛等有關。對于該病的辨證分型，各個醫家認識雖有不同，但基本同意濕熱內蘊是其常見證型，如楊維佳等選擇了近5年來50篇辨證治療慢性萎縮性胃炎的臨床研究文獻，共計5107例，辨證分型共29型，其中肝胃不和型939例；胃陰不足型902例；中虛氣滯型844例；脾胃虛寒型418例；脾胃虛弱型411例；脾胃濕熱型268例；其余分型所占比例都在5%以下。李衛強[8-9]從絡病論治胃癌前病變，認為陰血不足，絡脈瘀滯在胃癌前病變的形成中起到關鍵作用。他指出Hp感染是癌前病變的發病關鍵。中國中西醫結合研究會消化系統疾病專業委員會于2011年10月在天津最后討論審定了《慢性胃炎中西醫結合診療共識意見》將本病分為六型：肝郁氣滯、肝胃郁熱、脾胃濕熱、胃絡瘀阻、脾胃虛寒及胃陰不足證。總之大多中醫專家均認為慢性萎縮性胃炎的病因病機復雜，其產生主要為“毒邪”所致，致病因素中的物理、化學等因素均屬于“毒邪”范疇且人體內的濕熱、瘀血等病理產物日久可生毒。我院在古方“平胃散”的基礎上進一步研發的院內制劑中成藥“平胃膠囊”，療效頗豐。經過大量臨床、實驗研究證實，其可以清除Hp，改善PLGC黏膜炎癥，促進萎縮腺體的恢復，并在一定程度上可以治療、改善胃黏膜的腸化生或不典型增生，一定程度上達到預防胃癌發生的目的。因此中醫證型及中醫藥對PLGC的研究具有必要性。

胃癌的演變是一個多基因、多步驟、多途徑參與的復雜生物學過程。在此過程中有多種基因發生結構和表達的異常，涉及多種癌基因、抑癌基因、生長因子及其受體、細胞黏附分子及DNA修復基因等的異常積累。Survivin基因是1997年由耶魯大學Altieri等發現的一種抗凋亡因子，是凋亡抑制因子家族（inhibitor of apoptosis protein，IAP）的新成員。Kania等報道，在正常的胃黏膜中survivin mRNA有極低度表達，但無survivin蛋白表達。在癌組織和癌前組織中，survivin mRNA和蛋白的表達均顯著升高；survivin由于其特殊的作用及特異性的組織分布，以及其抑制細胞凋亡的功能活性，使其在腫瘤的發生、發展中起著關鍵性作用。已被視為早期胃癌診斷和治療的重要靶點。PTEN是一種腫瘤抑制基因，可以抑制腫瘤細胞浸潤轉移，加速細胞凋亡，阻止細胞增殖；當PTEN表達減弱或缺乏時，可使胃黏膜上皮易于發生惡性轉化，在胃癌發展中起一定作用。PTEN通過刺激CDX-2啟動子轉錄活性增強CDX-2的表達，提示在腸上皮化生至腸型胃癌的轉變中PTEN對CDX-2的表達可能起到一定的調節作用。實驗研究證明survivin是STAT3信號通路的一個下游基因，STAT3-Survivin信號通路等各種信號傳導通路與腫瘤關系的密切。同時Survivin與PTEN均參與細胞周期調控和細胞凋亡，在胃癌的發展中發揮協同效應，兩者作用環節一致，但生物學效應相反。隨著癌前病變向胃癌的發展，Survivin基因表達增高，而PTEN蛋白表達減低，Survivin與PTEN在異型增生和胃癌組織中的表達存在負性相關。

本研究從Survivin在胃癌癌前病變不同中醫證型中的表達及在不同病理類型中的表達進行了研究，結果顯示它們之間存在相關性，在陰虛內熱證、胃絡瘀阻證、Ⅲ型腸化生、異型增生中Survivin基因的陽性表達率明顯升高，說明癌變的概率較高，臨床治療中應對此類疾病更加重視。PLGC發病機制復雜，課題組從Survivin基因作了初步的研究，希望能夠為臨床提供更準確的立法方藥，為提高臨床療效提供科學的依據。因此，從中醫藥入手防治胃癌癌前病變，阻止其向胃Ca發展，是減少胃Ca發生率的有效措施。