黃瓜品種抗疫病鑒定及其防御相關酶系研究

柴喜榮，林 潔，楊 暹，康云艷

（華南農業大學園藝學院，廣東 廣州 510642）

疫病是危害黃瓜生產的毀滅性土傳病害，由疫霉菌侵染引起，苗期至成株期均可發病，潛育期短，傳播速度快，侵染力強，廣東省每年春植或夏、秋植黃瓜由疫病引起的死株率輕則10%，重則高達80%［1-2］。由于疫霉菌抗性來源的復雜性和疫霉菌發生遺傳變異的速度非常快，瓜類疫病抗性育種進展緩慢。目前，黃瓜品種中尚未發現對該病具有完全免疫或高抗的類型。一些農業措施如輪作、嫁接、清潔田園等，均有一定的減輕病害的效果，但均不能從根本上控制病害［3］。植物誘導抗病性產生常常伴隨著病程相關蛋白（Pathogenesis related protein，PRs）的大量積累。在這些PRs中，幾丁質酶（Chitinase，CHT）和葡聚糖酶（Glucanase，GLU）具有直接殺傷或抵抗病原物的活性與作用［4-5］；過氧化物酶（Peroxidase，POD）則參與細胞木質化過程，使細胞壁加強、抗病性增加；苯丙氨酸解氨酶（Phenylalnine ammonialyase，PAL）是植物保衛素、木質素和酚類化合物合成的關鍵酶和限速酶；多酚氧化酶（Polyphenoloxidase，PPO）可以在植物受病原菌侵染時氧化酚生成醌，對病菌產生抑制和毒害作用［6］。

本試驗通過灌根接種約5×103個/mL甜瓜疫霉菌游動孢子懸浮液，對不同來源的7個黃瓜品種進行抗病性篩選，并以篩選出的中農20號和正源油綠花青大吊瓜分別為感/抗品種，進一步探討疫霉菌對黃瓜葉片內病程相關蛋白POD、PPO、PAL、GLU、CHT活性的影響，研究結果可為揭示黃瓜疫霉菌抗性生理機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試黃瓜品種：中農20號由中國農業科學院蔬菜花卉研究所提供，正源油綠花青大吊瓜由汕頭市利農蔬菜良種研究所提供，長春密刺由哈爾濱金龍農業有限公司提供，津優1號由天津市黃瓜研究所提供，抗病二號、粵秀3號和早青二號由廣東省農業科學院蔬菜研究所提供。

供試菌種：甜瓜疫霉菌（Phytophthora melonis）由華南農業大學資源環境學院提供。將病原菌接種在胡蘿卜培養基上，置于26℃的人工氣候箱黑暗培養，7 d后加入適量土壤浸出液，26℃、全光照誘導游動孢子1～2 d，經血球計數板計數，配成終濃度約為5×103個/mL的游動孢子懸浮液。

胡蘿卜培養基：胡蘿卜200 g切片榨汁，加入蒸餾水浸泡5 min后過濾、定容至1 L，搖勻，然后按100 mL分裝，每瓶加入1.3 g瓊脂糖，121℃高壓蒸汽滅菌備用。

土壤浸出液：肥沃菜園土50 g，蒸餾水200 mL，攪拌，過濾，所得濾液即土壤浸出液。

1.2 試驗方法

試驗在華南農業大學蔬菜試驗基地進行。2013年7月1日，將7個黃瓜品種種子浸種催芽，發芽后播于裝有草炭∶珍珠巖∶蛭石=1∶1∶1混合基質的32孔育苗盤中，基質經134℃高溫蒸汽滅菌1 h，常規管理。7月14日黃瓜幼苗兩葉一心期，灌根接種約5×103個/mL疫霉菌游動孢子懸浮液，以清水作對照。接種前澆透水，取10 mL游動孢子懸浮液加至距植株莖基部2～3 cm處的基質內，接種后將植株置于鑒定室內保濕（RH為100%）24 h，以后保持土壤濕度近飽和，接種期間溫度控制在24～28℃。接種后2 d統計病情指數，并取各處理植株的第2片真葉，用于PPO、POD、PAL、CHT、GLU活性的測定。每個處理3次重復，每個重復32株。

1.3 測定項目及方法

1.3.1 黃瓜疫病抗性鑒定 根據NY/T 1857-2010 《黃瓜主要病害抗病性鑒定技術規程》稍作修改，游動孢子懸浮液接種量由2 mL/株改為10 mL/株，病情調查時間由接種后7 d 改為接種后3 d，計算病情指數，并評價黃瓜品種的抗病性。

（1）病情分級。室內病情分級及其癥狀描述見表1。

表1 黃瓜疫病病情分級標準

（2）病情指數。病情指數計算公式為：

式中，DI為病情指數，s為各病情級別代表數值，n為各病情級別病株數，N為調查總株數，S為最高病情級別代表值。

（3）抗性評價標準。根據發病材料的病情指數，確定其對疫病的抗性水平，劃分標準見表2。

表2 黃瓜對疫病抗性評價標準

1.3.2 酶活性測定 POD、PAL、PPO活性測定參照Chen等［7］的方法，CHT、GLU活性測定參照Ge等［8］的方法。

試驗數據采用Excel 2010和SPSS Statistics 17.0軟件進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 不同黃瓜品種抗病性鑒定

如圖1所示，本試驗7個黃瓜品種接種5×103個/mL甜瓜疫霉菌游動孢子后，各品種對疫霉菌的抗性表現不同，由強到弱依次為花青大吊瓜＞長春密刺＞粵秀3號＞抗病2號＞津優1號＞中農20號＞早青2號。其中，長春密刺、正源油綠花青大吊瓜、抗病二號和粵秀3號 等4個品種病情指數范圍均表現出中抗，品種間抗性無顯著差異；中農20號、早青二號和津優1號3個品種病情指數范圍均表現出感病，品種間抗性亦無顯著差異。本試驗選定中抗品種花青大吊瓜、感病品種中農20號進一步探討葉片中病程相關蛋白的變化規律。

圖1 不同黃瓜品種接種甜瓜疫霉菌后的病情指數

2.2 接種疫霉菌對不同抗性黃瓜品種葉片POD活性的影響

從圖2可以看出，未接種疫霉菌條件下，中抗品種葉片POD活性顯著高于感病品種；接種疫霉菌顯著誘導提高了抗感品種葉片POD活性，與對照相比，感病品種中農20號POD活性提高150%，中抗品種花青大吊瓜提高91%，但中抗品種的POD活性仍然高于感病品種。

圖2 接種疫霉菌對黃瓜葉片POD活性的影響

2.3 接種疫霉菌對不同抗性黃瓜品種PPO活性的影響

從圖3可以看出，未接種疫霉菌條件下，中抗品種葉片PPO 活性顯著高于感病品種；接種疫霉菌顯著誘導提高了感病品種中農20號葉片PPO活性，與對照相比，葉片PPO活性提高211%，而對中抗品種花青大吊瓜葉片PPO活性無顯著誘導作用。接種病原菌后，感病品種中農20號葉片PPO活性顯著高于中抗品種花青大吊瓜。

圖3 接種疫霉菌對黃瓜葉片PPO活性的影響

2.4 接種疫霉菌對不同抗性黃瓜品種PAL活性的影響

由圖4可知，未接種疫霉菌條件下，中抗品種葉片PAL活性顯著高于感病品種；接種疫霉菌顯著誘導提高抗感品種葉片PAL活性，與對照相比，感病品種中農20號PAL活性提高321%，中抗品種花青大吊瓜提高93%，但中抗品種的PAL活性仍然高于感病品種。

圖4 接種疫霉菌對黃瓜葉片PAL活性的影響

2.5 接種疫霉菌對不同抗性黃瓜品種CHT活性的影響

從圖5可以看出，未接種疫霉菌條件下，感病品種中農20號葉片CHT活性顯著高于中抗品種花青大吊瓜；接種疫霉菌對抗/感品種葉片CHT活性均無顯著影響。

圖5 接種疫霉菌對黃瓜葉片CHT活性的影響

2.6 接種疫霉菌對不同抗性黃瓜品種GLU活性的影響

從圖6可以看出，未接種疫霉菌條件下，中抗品種葉片GLU 活性顯著高于感病品種；接種疫霉菌顯著誘導提高感病品種中農20號葉片GLU活性，與對照相比，葉片GLU活性提高144%，而接種疫霉菌對中抗品種花青大吊瓜葉片GLU活性無顯著誘導作用。接種病原菌后，感病品種中農20號葉片GLU活性顯著高于中抗品種花青大吊瓜。

圖6 接種疫霉菌對黃瓜葉片GLU活性的影響

3 結論與討論

本試驗以7個不同黃瓜品種進行疫病的抗病性篩選，其中長春密刺、正源油綠花青大吊瓜、抗病二號和粵秀3號4個品種抗性較強，為中抗品種；中農20號、早青二號和津優1號3個品種抗性較弱，為感病品種，沒有發現高抗或免疫品種。進一步的試驗以中農20號和花青大吊瓜分別為感/抗材料，用于測定防御相關酶活性，結果表明，未接種疫霉菌條件下，正源油綠花青大吊瓜黃瓜葉片的POD、PPO、PAL、GLU活性均顯著高于感病品種中農20號。接種疫霉菌游動孢子懸浮液后，中抗品種花青大吊瓜葉片的POD、PAL活性顯著升高，其余相關酶活性無顯著變化；感病品種中農20號葉片POD、PPO、PAL、GLU活性顯著增強，且增幅均大于中抗品種花青大吊瓜；接種前后兩個品種的CHT活性均無明顯變化。由此可以推測，未接種疫霉菌條件下，中抗品種植株葉片內含有更高的防御相關酶活性，病原菌侵染后，植株能迅速提高POD、PAL活性，增強細胞壁，來抵御病原菌的侵染；相反，未接種疫霉菌條件下，感病品種中農20號葉片內防御相關酶活性水平低，植株被疫霉菌侵染后，葉片內除了POD、PPO、PAL細胞壁相關酶活性上升外，GLU活性也迅速升高，原因可能是病菌侵染細胞后，感病黃瓜品種的膜系統受損、透性增加，酶與底物無控制地接觸，從而表現為酶促反應加速、酶活性提高，GLU的合成與積累顯著被誘導，參與了植株對病原菌的防御；接種前后感/抗品種CHT活性均無明顯變化，原因可能是甜瓜疫霉菌細胞壁中沒有幾丁質，因此幾丁質酶活性沒有受誘導。

POD、PPO、PAL是植物次生代謝過程中的3個關鍵酶，不僅是重要的內源活性氧清除劑，而且主要負責催化細胞壁中的大分子物質交聯以加強細胞壁的結構或修復受損的細胞壁，屬于植物防衛系統相關酶，因此可作為植物抗病的生化指標［9-11］。在植物抗病防御系統中，CHT和GLU的作用也受到普遍關注，如CHT和GLU能直接攻擊病原物，特別是病原真菌；GLU和CHT可以直接酶解病原真菌的細胞壁使致病病原物瓦解，失去致病能力；酶解后病原物的細胞壁破碎物又可以作為激發子再次刺激植物產生抗病防衛反應，從而達到抗病的目的［12］。

POD、PPO、PAL、GLU、CHT與植物抗病性的關系在不同植物、多種病害的研究結論不甚一致。侯茜等［13］研究表明，POD、PPO、PAL、CHT的活性與抗病性呈正相關，可用西瓜幼苗根部POD、PPO、PAL、CHT的活性作為反映苗期西瓜材料枯萎病抗性的生理生化指標；李新等［14］對黃瓜不同品種苗期感染枯萎病菌后幾種酶活性變化的研究發現，接種枯萎病菌后，抗/感品種3種酶活性均增高，但抗病品種的酶活性增加幅度高于感病品種；相反，劉守偉等［15］對黃瓜與枯萎病菌的研究指出，不同抗性黃瓜品種接種枯萎病菌后抗/感品種POD、PPO活性都升高，但感病品種上升速度快、幅度大；張少英等［16］對甜菜與叢根病的研究發現，供試4個甜菜品種的CHT和GLU活性均表現為抗病品種高于感病品種；左豫虎等［17］對大豆與疫霉根腐病的研究指出，大豆對大豆疫霉根腐病的抗性與CHT、GLU活性呈正相關關系；Liang等［18］對黃瓜與白粉病的研究指出，接種白粉病菌能夠誘導黃瓜葉片CHT活性升高，且CHT活性與黃瓜抗病性呈正相關；而莫熙禮等［19］對辣椒與白粉病菌的研究指出，CHT活性與辣椒的抗病性無相關性，該結果與許多學者研究結果不一致。