華南地區豬圓環病毒3型分子流行病學研究

蔣智勇，蔡汝健，楚品品，林德銳 ，勾紅潮，李 艷，宋 帥，李春玲

（1.廣東省農業科學院動物衛生研究所/ 廣東省畜禽疫病防治研究重點實驗室/廣東省獸醫公共衛生公共實驗室/農業部獸用藥物與診斷技術廣東科學觀測實驗站，廣東 廣州 510640；2. 廣東永順生物制藥股份有限公司，廣東 廣州 511356）

豬圓環病毒（Porcine circovirus，PCV）屬于圓環病毒科（Circoviridae）圓環病毒屬（Circovirus），為無囊膜的單股環狀DNA（ssDNA）病毒，基因組約2 kb，是最小的自主復制病毒基因組?，F已知PCV有PCV1和PCV2 2個血清型［1］，其中PCV1不具有致病性，而PCV2能引起斷奶仔豬多系統衰竭綜合征、豬皮炎腎病綜合征、豬增生性壞死性肺炎及其他豬圓環病毒相關疾病［2-3］。

2016年美國學者從豬群中檢測到一種能引起母豬皮炎腎病綜合征與繁殖障礙的PCV3，該病毒從出現病癥的母豬或仔豬中分離得到，同時PCV2檢測為陰性［4-5］?；蚪M序列分析發現，PCV3基因組包含2 000 bp，具有與PCV1和PCV2相似的基因組結構，主要編碼Cap和Rep兩個基因［5］。隨后在我國遼寧、福建、河北、江西、重慶、廣東、廣西和山東等地也有發現PCV3 感染［6-8］。

為更好地了解和監控PCV3在華南地區的流行、遺傳進化以及毒株的變異情況，本研究應用熒光定量PCR技術對華南地區豬場送檢的臨床樣品進行PCV3檢測，并對陽性樣品進行全基因組擴增和測序，以了解PCV3的分子流行病學狀況，為PCV3的免疫預防和分子致病機制研究等提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

病料采自2017年華南地區（廣東、海南、廣西和湖南）26個豬場，共采集樣品246份，包括淋巴結、脾臟、肺臟、血清、精液以及流產胎兒等。

主 要 試 劑：PremixExTaqTM和DL 2000 Marker為大連寶生物工程有限公司產品（TaKaRa），病毒DNA/RNA提取試劑盒為Magen公司產品，Taq PreMix聚合酶為Promega公司產品。

1.2 試驗方法

1.2.1 引物設計與合成 參照Palinski等［5］合成1對引物用于PCV3的熒光定量PCR檢測，并設計2對引物用于PCV3全基因組擴增（表1）。引物所在位置參照PCV3株（GenBank收錄號：KY075988.1），引物和探針由上海生工生物工程有限公司合成。

表1 PCV3引物和探針序列

1.2.2 PCV3熒光定量PCR檢測 病毒DNA的提取按照病毒DNA/RNA 提取試劑盒操作說明書進行，提取的DNA用于熒光定量PCR擴增。擴增方法參照Palinski等［5］進行臨床樣品的PCV3檢測并統計結果。

1.2.3 PCV3全基因組序列測定與分析 PCV3全基因組擴增反應體系（50μL） ：去離子水21μL，上、下游引物各1μL（工作濃度0.2μmol/L），2×PremixEx Taq25μL， 提取的DNA模板2μL。擴增反應條件：95℃預變性5 min；95℃變性20 s、60℃退火30 s、72℃延伸 90 s，共 35個循環；72℃后延伸5 min。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，對符合預期大小的PCR產物送上海生工生物工程有限公司測序。

1.2.4 全基因序列的拼接及系統進化樹分析將測序獲得的2 段序列進行拼接后得到PCV3的全基因序列，應用生物學分析軟件DNAStar、ClustalX 2.1和Mega 6.0對PCV3全基因組及ORF2基因序列以及推導的氨基酸序列與國內外PCV3參考毒株序列進行比對并繪制遺傳進化樹。

2 結果與分析

2.1 PCV3臨床樣品的檢測

應用熒光定量PCR方法對26個豬場臨床送檢的組織、精液和血清共246份樣品進行檢測，結果26個豬場中有19個豬場為PCV3陽性場，豬場陽性率為69.2%（18/26），PCV3樣品總檢出陽性率為46.3%（114/246）。

2.2 PCV3的PCR檢測及全基因組擴增

經熒光定量PCR檢測為陽性的病料和血清進行全基因組擴增，引物PCV3-F1/PCV3-R1經PCR擴增后獲得大小為1.1 kp的片段，引物PCV3-F2/PCV3-R2擴增的PCR產物片段約1.2 kb（圖1），與預期大小相符。將PCR產物送到上海生工生物工程有限公司進行測序并拼接，用于遺傳信息分析。

圖2 基于PCV3全基因序列的遺傳進化樹

2.3 PCV3全基因組的遺傳進化分析

圖1 PCV3全基因組PCR產物電泳結果

將擴增測序的毒株序列拼接后提交GenBank，獲得7株PCV3，分別命名為GDFS、GD-GZ、GD-JM、GD-MZ、GD-YF、GX 2017和Hainan株，GenBank收錄號分別為MG253678～MG253684。對分離的 7株 PCV3毒株與來自美國（US-MO2015、US-MN2016）、意大利（PCV3-IT CO2017）［9］、韓國（KU-1601，KU-1607）［10］和國內的 9株 PCV3毒株序列應用DNAstar的MegAline軟件進行核苷酸同源性比較分析并構建了遺傳進化樹（圖2）。結果表明，分離測序的7株PCV3毒株之間的核苷酸序列同源性為98.9%～99.8%，PCV3分離株與PCV3國內外參考毒株的核苷酸同源性在97.4%～99.8%之間。PCV3可分為PCV3a、PCV3b和PCV3c 3個亞群，在華南地區分離的7株PCV3分別有2株、2株和3株分別位于PCV3a、PCV3b和PCV3c亞群，表明PCV3在華南地區呈現出遺傳多樣性。

2.4 PCV3 ORF2基因的遺傳進化分析

PCV3 ORF2基因長645 bp，編碼214 aa，PCV3 ORF2基因比PCV2的ORF2基因短。本研究分離測序的7株PCV3毒株之間的核酸序列同源性為98.1%～99.5%，而與PCV3國內外參考毒株的核苷酸同源性在96.6%～99.8%之間。

分離的7株PCV3 ORF2基因推導的氨基酸序列與參考毒株同源性在96.7%～99.5%之間。ORF2基因編碼的Cap蛋白序列出現了4處比較一致的突變，分別為V24A、K27R、T77S和L150I?；?PCV3 ORF2基因構建的遺傳進化樹（圖3）與PCV3全基因組構建的遺傳進化樹（圖2）存在部分差異，結果同樣表明這些毒株可以大致分為3個分支（PCV3a、PCV3b和PCV3c）。GD-GZ與參考毒株Jiangxi-62-2016、KU-1607-2016和 PCV3-IT CO2017具有V24A和K27R突變屬于PCV3c，GD-MZ與參考毒株Anhui-14-2016、PCV3 Fujian和Henan-13-2016株具有T77S和L150I突變屬于PCV3b，GD-YF和Hainan株同時具有PCV3c的V24A和PCV3b的T77S突變暫歸為PCV3c，GD-JM具有1處L150I突變，不具有這4處突變的GX 2017和GD-FS株與其余的參考毒株屬于PCV3a（圖4）。

圖3 基于PCV3 ORF2基因序列的遺傳進化樹

3 結論與討論

自2016年以來，我國部分?。ㄊ校┫嗬^出現以母豬流產和死亡、斷奶仔豬呼吸衰竭和死亡為臨床特征的PCV3感染報道［8,11］，也有研究表明PCV3可引起仔豬腹瀉［12］。目前尚不清楚PCV3的起源，追溯性研究表明PCV3于2015年即存在于我國豬場，此后呈現上升趨勢［13］。

目前國內外先后建立了PCR、熒光定量PCR、ELISA以及鑒別診斷PCV2與PCV3的雙重熒光定量PCR方法［14-18］。本研究應用熒光定量PCR方法對臨床樣品進行PCV3檢測，結果PCV3總檢出率為46.3%（114/246），豬場陽性率為69.2%（18/26）。PCV3可以在不同的豬組織如腦、肺、脾臟、淋巴結、扁桃體、心臟、腎以及精液和血清中均可檢出，其中以肺和淋巴結檢出率最高，研究結果表明PCV3在華南地區已廣泛存在。

將PCV3熒光PCR檢測為陽性的樣品進行全基因組擴增與測序分析，共獲得7株PCV3全基因組序列，PCV3全基因組長為2 000 bp，ORF2基因長為645 bp。本研究分離的7株PCV3與國內外的參考毒株的全基因組核苷酸同源性在97.4 %～99.8%之間，ORF2基因的同源性在96.6%～99.8%之間。基于ORF2基因構建的遺傳進化樹可以將PCV3分為PCV3a、PCV3b和 PCV3c亞 型， 與 Fu等［13］以 PCV3 Cap蛋白的V24A、K27R突變將PCV3分為3個亞型結果一致。 本研究進一步結合另外2個突變T77S和L150I作為分型依據。中國分離株與美國、歐洲和韓國分離株具有很高的同源性，也說明PCV3毒株的基因組比較穩定。本研究對PCV3的分子流行病學研究為開展PCV3的監測與防控提供了技術支持，PCV3的致病性與PCV2的關系等有待進一步研究。

圖4 PCV3分離株Cap蛋白推導的氨基酸序列比對分析