雌馬酚對糖尿病大鼠心肌內質網應激和細胞凋亡的影響

白跳,遲麗屹,高宇勤,胡小菁*

(1西安市第九醫院老年病一科,西安 710054;2解放軍第四五一醫院神經內科;3西安市第九醫院心血管內科;*通訊作者,E-mail:huxiaojingxb@126.com)

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy)是糖尿病患者常見的心臟并發癥[1],其病理過程獨立于冠心病、高血壓和其他心血管疾病。雖然糖尿病心肌病發病的機制尚不清楚,但心肌細胞凋亡已被證明在本病發展中起重要作用[1,2]。心肌細胞凋亡可由不同機制引起,其中內質網應激依賴性細胞凋亡已得到證實[3,4]。

雌馬酚(7-羥基-3-(49-羥基苯基)-苯并二氫吡喃)是大豆黃素的天然特異性代謝產物[5],已報道其具有心臟保護作用、抗癌作用等多種特性[6],但只有30%-50%的人能夠在腸道中自體產生雌馬酚[6]。與雌馬酚的前體大豆黃素相比,雌馬酚具有更高的抗氧化活性和內質網親和力[7]。已有文獻表明,雌馬酚通過抑制內質網應激,緩解載脂蛋白E缺陷小鼠的動脈粥樣硬化[8]。因此,本研究擬探討雌馬酚對糖尿病心肌病大鼠心肌內質網應激和細胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

8周齡雄性Wistar大鼠24只,SPF級,體質量200-250 g,由西安交通大學動物實驗中心提供,動物許可證號:SYXK(陜)2016G006。

1.2 主要試劑

雌馬酚購自南京恩明醫藥科技有限公司(批號:CB2317528),鏈脲佐菌素(STZ)購自美國sigma公司,GRP78抗體、C/EBP同源蛋白(CHOP)抗體和激活轉錄因子-6(ATF-6)抗體購自美國Abcam公司,β-actin抗體購自美國Santa Cruz公司,活化caspase-3抗體、總caspase-3、Bax、Bcl-2抗體購自美國Cell signaling technology公司,蛋白提取試劑盒和BCA蛋白濃度檢測試劑盒購自碧云天生物公司。

1.3 實驗分組及模型制備

將大鼠隨機分為對照組糖尿病組和雌馬酚組,每組各8只。對照組采用普通飼料喂養,糖尿病組和雌馬酚組大鼠以含10%豬油和20%蔗糖的高糖高脂飼料喂養,飼養后第56天(第8周)腹腔按注射STZ 45 mg/kg(溶于枸櫞酸鈉緩沖液,pH 4.2)一次,對照組腹腔注射等量枸櫞酸緩沖液[9]。STZ注射后第72小時,斷尾采血用拜安捷血糖測定儀測定空腹血糖,以>11.6 mmol/L確定為糖尿病模型大鼠。模型制備完成后,雌馬酚組大鼠改為食用含0.1%雌馬酚的高糖高脂飼料,糖尿病組和對照組大鼠繼續按原方案進食[8]。STZ注射后第12周,以2.5%戊巴比妥鈉50 mg/kg處死大鼠,收集靜脈血檢測生化指標和心肌酶譜,取心臟組織用Western blot法檢測相應蛋白表達水平。

1.4 生化指標及心肌酶譜檢測

經下腔靜脈取血,測定空腹血糖并用全自動生化分析系統(OLYPUS AU2700)測定甘油三酯、總膽固醇及心肌酶肌酸磷酸激酶-MB同功酶(CK-MB)、乳酸脫氫酶(LDH)和天冬氨酸氨基轉移酶(AST)水平。

1.5 Western blot法蛋白檢測

取心肌組織約200 mg，按照100 mg/ml的比例加入RIPA裂解液，液氮下充分裂解，于4 ℃離心機中以12 500g離心15 min，取上清用BCA法檢測蛋白濃度。取蛋白行SDS-PAGE電泳并電轉至PVDF膜上。室溫下5%脫脂牛奶封閉1 h后，加入一抗(GRP78抗體1 ∶1 000；CHOP抗體1 ∶2 000；ATF-6抗體1 ∶1 000；β-actin抗體1 ∶500；活化caspase-3抗體1 ∶500；總caspase-3抗體1 ∶1 000；Bax抗體1 ∶1 000；Bcl-2抗體1 ∶1 000)，4 ℃孵育過夜。次日加入山羊抗兔或者山羊抗小鼠辣根過氧化物酶標記二抗室溫孵育1 h。TBST緩沖液充分洗滌后，行ECL顯色，在凝膠成像系統中成像。

1.6 統計學分析

2 結果

2.1 雌馬酚對糖尿病大鼠代謝及生化指標的影響

與對照組比較,糖尿病組大鼠體質量顯著下降,空腹血糖、總膽固醇(TG)水平顯著升高(P<0.05)。與糖尿病組比較,雌馬酚組大鼠體質量顯著增加,空腹血糖和總膽固醇明顯降低(P<0.05)。而三組大鼠血漿甘油三酯水平比較差異無統計學意義(P>0.05,見表1)。

2.2 雌馬酚對糖尿病大鼠心肌酶譜的影響

與對照組比較,糖尿病組大鼠血漿心肌酶LDH、CK-MB、AST水平均增高(P<0.05,見表2),說明糖尿病組大鼠出現了明顯的心肌損傷。但與糖尿病組比較,雌馬酚組大鼠血漿中LDH、CK-MB、AST水平顯著降低(P<0.05,見表2)。

組別體質量(g)空腹血糖(mmol/L)總膽固醇(mmol/L)甘油三酯(mmol/L)對照組 406±555.3±0.71.21±0.280.91±0.12糖尿病組 191±42?18.9±2.7?1.59±0.13?0.99±0.13雌馬酚組 301±26#6.1±1.5#1.25±0.17#0.90±0.06

與對照組比較,*P<0.05;與糖尿病組比較,#P<0.05

表2 三組大鼠血漿心肌酶學檢測結果的比較Table 2 Comparison of serum myocardial enzymes among three

與對照組比較,*P<0.05;與糖尿病組比較,#P<0.05

2.3 雌馬酚對心肌內質網應激相關指標GRP78、CHOP、ATF-6蛋白表達的影響

與對照組比較,糖尿病組大鼠心肌內質網應激相關指標GRP78、CHOP、ATF-6的蛋白表達水平顯著增多(P<0.05);而與糖尿病組比較,雌馬酚組大鼠心肌GRP78、CHOP、ATF-6蛋白表達水平明顯減少(P<0.05,見圖1)。

2.4 雌馬酚對心肌活化caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表達的影響

與對照組比較,糖尿病組大鼠心肌活化caspase-3、促凋亡蛋白Bax蛋白表達增多,而抗凋亡蛋白Bcl-2減少(P<0.05,見圖2);而與糖尿病組比較,雌馬酚組大鼠心肌活化caspase-3和Bax蛋白表達水平明顯減少,而抗凋亡蛋白Bcl-2顯著增多(P<0.05,見圖2)。

與對照組比較,*P<0.05;與糖尿病組比較,#P<0.05圖1 雌馬酚對心肌GRP78、CHOP、ATF-6蛋白表達的影響Figure 1 Effects of equol on the protein expression of GRP78, CHOP and ATF-6 in myocardium

與對照組比較,*P<0.05;與糖尿病組比較,#P<0.05圖2 雌馬酚對心肌活化caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表達的影響Figure 2 Effects of equol on the protein expression of activated caspase-3, Bax and Bcl-2 in myocardium

3 討論

本研究采用高脂高糖飲食誘發胰島素抵抗并單次注射鏈脲佐菌素(STZ)導致胰腺β細胞的部分功能失調的方法制備Ⅱ型糖尿病的大鼠動物模型[8,10]。該方法處理的大鼠出現了明顯的高糖血癥和高膽固醇血癥,提示糖尿病模型構建成功。本研究結果顯示,糖尿病組大鼠血漿心肌酶LDH、CK-MB、AST均較對照組顯著增加,提示糖尿病組大鼠心肌損傷出現。而在食物中添加0.1%的雌馬酚導致糖尿病大鼠血糖、總膽固醇和血漿心肌酶的下調,表明雌馬酚可減輕糖尿病大鼠糖脂代謝異常和心肌損傷。

內質網是分泌或跨膜蛋白折疊、鈣儲存和脂質合成的中心細胞器。當內質網穩態破壞時,在其內腔中產生適應性信號傳導途徑激活,即內質網應激。內質網應激已被證實參與多種代謝疾病的發生和發展,包括Ⅱ型糖尿病、動脈粥樣硬化等[11]。GRP78是一種位于內質網內的鈣離子結合分子伴侶,當細胞出現內質網應激時,細胞內會產生大量錯誤折疊或未折疊蛋白蓄積,GRP78會和內質網跨膜相關傳感器蛋白(如ATF-6)分離,進而導致下游CHOP相關凋亡信號通路的激活[12]。慢性病理性內質網應激所導致心肌細胞損傷及細胞凋亡,是多種心血管疾病如糖尿病心肌病、冠心病、高血壓性心肌病、慢性心力衰竭的初始事件[13]。與之一致,本研究結果顯示,糖尿病組大鼠心肌GRP78、ATF-6和CHOP表達較對照組顯著增加。而雌馬酚可明顯減少心肌GRP78、ATF-6和CHOP的蛋白表達水平,說明雌馬酚可緩解糖尿病大鼠出現的內質網應激。

心肌細胞凋亡是在糖尿病心肌病中心肌功能障礙的重要機制[1,2,14]。已有報道指出,糖尿病動物模型和患者中心肌細胞凋亡是導致心肌細胞損失、心肌重塑和功能障礙的主要原因[1,15]。本研究結果表明,雌馬酚可減少糖尿病大鼠心肌凋亡相關分子活化caspase-3和Bax的表達,并增加抗凋亡蛋白Bcl-2的表達,說明雌馬酚可減輕糖尿病心肌病大鼠的心肌細胞凋亡。而心肌細胞凋亡可由不同機制引起,如棕櫚酸毒性、自由基形成、內質網應激等。其中內質網應激在心肌細胞凋亡中的作用已引起研究者的重視[3,4]。已有證據表明雌馬酚通過抑制內質網應激緩解載脂蛋白E缺陷小鼠的內皮細胞凋亡[8]。這就說明,雌馬酚的抗心肌細胞凋亡作用可能與其減輕內質網應激作用相關。

綜上所述,雌馬酚可能通過緩解糖尿病大鼠心肌內質網應激緩解心肌細胞凋亡,從而緩解糖尿病大鼠代謝功能異常和心肌損傷的發展。