山莨菪堿預處理對大鼠肝缺血再灌注誘發多器官損傷的影響

周榮勝,薛小紅,李小剛,畢 陽,何 平,王 強

(1西安交通大學第一附屬醫院麻醉科,西安 710061;2西安交通大學第一附屬醫院血液凈化科)

肝切除、肝移植等手術中常出現肝缺血/再灌注的操作,肝缺血/再灌注過程不僅造成肝本身的損傷,而且對遠隔器官如肺、腎、腸道、心肌等造成損傷[1]。山莨菪堿為M膽堿受體拮抗劑,具有改善微循環作用、改善血管內皮通透性和組織氧攝取等作用。近年來研究發現山莨菪堿對生命重要器官如腦、肝、腎、心等器官的缺血再灌注損傷具有良好的保護作用[2]。本研究制作70%肝臟缺血再灌注損傷大鼠模型,以山莨菪堿進行預處理,旨在探討山莨菪堿預處理對大鼠肝缺血再灌注誘發多器官損傷的影響,為臨床防治提供理論支持。

1 材料和方法

1.1 主要試劑及儀器

鹽酸消旋山莨菪堿注射液(天津金耀氨基酸有限公司,批號:1409051);7600大型全自動化生化分析儀(日立公司,日本);大鼠TNF-α、IL-6 ELISA試劑盒(美國R&D公司);MDA、MPO和SOD試劑盒購自南京生物建成工程研究所;圖像采集系統、光學顯微鏡等由西安交通大學醫學部病理學實驗室提供。

1.2 動物分組和模型制備

雄性SD大鼠60只,清潔級,6-8周齡,體質量210-280 g,由西安交通大學醫學部動物實驗中心(生產許可證:SYXK陜2014-003)提供,分別為假手術組(CON組)、肝臟缺血再灌注組(IR組)和山莨菪堿預處理組(ANI組),每組20只。CON組:大鼠開腹后分離肝門不做結扎;IR組:大鼠開腹后結扎肝門,阻斷肝血流60 min后,開放血流3 h后處死大鼠;ANI組:結扎肝門即阻斷肝血流前30 min,自尾靜脈注射稀釋成1 ml的山莨菪堿(2 mg/kg),其余同IR組,阻斷肝血流60 min。CON組和IR組自尾靜脈注射1 ml的生理鹽水。

按Nauta等[3]的方法制作70%肝缺血再灌注大鼠模型:術前禁食12 h,自由飲水,腹腔注射10%水合氯醛(400 mg/kg)麻醉大鼠,仰臥位固定于操作臺上。經陰莖背靜脈注入稀釋肝素(200 U/kg),使其肝素化。自腹下部沿正中線縱行向上剪開皮膚,直至胸腹交界處。逐層打開腹腔,分離肝門及肝十二指腸韌帶,尋找到肝門,IR組和ANI組用小動脈夾夾閉肝左葉和肝中葉部分肝門,60 min后松開小動脈夾肝臟恢復血流,然后逐層關閉腹腔,3 h后處死大鼠。CON組只解剖肝門不作血管夾閉。

1.3 標本的采集

大鼠處死前,取下腔靜脈血,分離血清,-20 ℃保存,用于檢測ALT、AST、BUN、CRE、TNF-α和IL-6。大鼠處死后,取肝左葉、右肺上葉、左腎上極和部分回腸組織置于10%中性甲醛浸泡固定,用于HE染色和免疫組化,檢測MDA、MPO含量和SOD活性。

1.4 組織形態學觀察(HE染色)

取部分肝、肺、腎和回腸組織經過脫蠟,水化,染色,脫水,透明,封片,在100倍光鏡下觀察其組織病理形態學變化,采集圖像。

1.5 生化指標檢測

采用全自動化生化分析儀檢測血清ALT、AST、BUN和CRE的濃度。

1.6 肝、肺、腎和回腸組織MDA、MPO含量和SOD活性的測定

取部分肝、肺、腎和回腸組織50 mg用冷生理鹽水制成肺組織勻漿,4 ℃ 3 000 r/min離心10 min,上清-80 ℃保存,檢測前再次離心取上清;分別采用硫代巴比妥酸法測定MDA含量、黃嘌呤氧化酶法測定SOD活性和過氧化氫還原法測定MPO活性,嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.7 ELISA法檢測血清TNF-α、IL-6表達

取部分保存好的血清,再次離心取上清;采用大鼠TNF-α ELISA試劑盒和IL-6 ELISA試劑盒測定TNF-α、IL-6的表達,嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.8 統計學分析

2 結果

2.1 光鏡下肝、肺、腎和回腸組織病理學變化

CON組肝、肺、腎和回腸結構完整,未見明顯的異常;IR組肝、肺、腎和回腸血管充血,可見紅色滲出液,組織間水腫,有大量炎性細胞浸潤;ANI組肝、肺、腎和回腸可見充血水腫,肺間質增厚有炎性細胞浸潤,但較IR組輕(見圖1-4)。

2.2 生化指標變化

與CON組比較,IR組和ANI組血清ALT、AST、BUN和CRE濃度顯著增高(P<0.05);與IR組相比較,ANI組血清ALT、AST、BUN和CRE濃度顯著降低(P<0.05,見表1)。

A. CON組B. IR組 C. ANI組圖1 光鏡下三組肝組織病理學變化 (×100)Figure 1 Histopathological changes of liver tissues under light microscope in three groups (×100)

A. CON組B. IR組 C. ANI組圖2 光鏡下三組肺組織病理學變化 (×100)Figure 2 Histopathological changes of lung tissues under light microscope in three groups (×100)

A. CON組B. IR組 C. ANI組圖3 光鏡下三組腎組織HE染色結果 (×100)Figure 3 Histopathological changes of kidney tissues under light microscope in three groups (×100)

A. CON組B. IR組 C. ANI組圖4 光鏡下三組回腸組織HE染色結果 (×100)Figure 4 Histopathological changes of ileum tissues under light microscope in three groups (×100)

2.3 肝、肺、腎和回腸組織MDA含量、MPO和SOD活性變化

與CON組比較,IR組和ANI組肝、肺、腎和回腸組織MDA含量、MPO活性顯著增高(P<0.05),SOD活性顯著降低(P<0.05);與IR組相比較,ANI組肝、肺、腎和回腸組織MDA含量、MPO活性顯著降低(P<0.05),SOD活性顯著增高(P<0.05,見表2)。

表1 肝腎功能生化指標變化的比較Table 1 Comparison of biochemical indexes of liver and kidney function among three

與CON組比較,*P<0.05;與IR組比較,#P<0.05

表2 肝、肺、腎和回腸組織MDA含量、MPO和SOD活性變化比較Table 2 Comparison of MDA content, MPO and SOD activities in liver, lung, kidney and ileum among three

與同一臟器CON組比較,*P<0.05;與同一臟器IR組比較,#P<0.05

2.4 血清TNF-α、IL-6濃度變化

與CON組比較,IR組和ANI組血清TNF-α、IL-6濃度顯著增高(P<0.05);與IR組相比較,ANI組血清TNF-α、IL-6濃度顯著降低(P<0.05,見表3)。

表3 血清TNF-α、IL-6濃度變化比較Table 3 Comparison of serum concentrations of TNF-α and IL-6 among three

與CON組比較,*P<0.05;與IR組比較,#P<0.05

3 討論

肝缺血再灌注損傷(hepatic ischemia reperfusion injury,HIRI)是肝臟外科手術如肝部分切除、肝移植等臨床治療過程中常見并發癥,也是引發患者肝移植失敗、肝功能衰竭及愈后較差的關鍵因素。HIRI過程中產生大量活性氧自由基、炎性因子和內毒素移位,造成肝細胞本身發生損傷的同時,也會使遠隔臟器受到缺血/再灌注過程的損傷,如肺、腎、小腸、胰腺、腎上腺和心肌等重要器官,可能進一步導致多器官功能障礙綜合征[4]。HIRI的病理生理機制是多組織器官、多種因素、多種學科交叉關聯并相互制約的復雜過程,氧化應激反應、代謝障礙、細胞凋亡、活化細胞釋放炎癥介質等被認為參與其主要過程,產生的有害細胞因子是非特異性的,它們作用于全身各個器官,影響它們的功能,甚至出現不可逆的損傷,進而出現多器官功能障礙的級聯反應[5]。研究發現,HIRI能加重大鼠肺損傷,導致氧化應激反應,上調肺組織中的HO-1及iNOS表達[6]。本實驗研究結果顯示,與CON組比較,IR組和ANI組肝、肺、腎和回腸組織HE染色病理改變顯著加重,IR組和ANI組血清AST、ALT、BUN、CRE、TNF-α和IL-6含量及肝、肺、腎和回腸組織MDA含量、MPO活性顯著增高,SOD活性顯著降低;表明肝缺血再灌注引起肝臟病理改變和肝功能受損的同時,產生了大量的炎性因子,造成了肺、腎和回腸的損傷。

山莨菪堿是提取自茄科植物山莨菪中的一種生物堿,與阿托品等莨菪烷類藥物同屬于M膽堿受體拮抗劑[7]。主要用于治療胃腸道痙攣收縮所引起的腹痛、感染中毒性休克等[8]。近年來研究證實山莨菪堿對多個器官缺血-再灌注損傷具有良好的保護作用[9]。有研究發現山莨菪堿可降低多器官功能障礙綜合征(MODS)的發生率,其機制可能是通過減輕血管內皮細胞(VECs)損傷和改善血管通透性,從而減輕組織和肺水腫,改善肺氧合功能和組織氧攝取、氧代謝,降低組織細胞的缺氧而減輕或延遲器官功能損傷和MODS的發生[10]。有研究顯示,山莨菪堿聯合烏司他丁能有效抑制危重型多發傷患者炎癥反應,保護重要臟器功能[11]。山莨菪堿可能通過抑制細胞因子TNF-α、IL-6、IL-1等的釋放,抑制中性粒細胞聚集和氧自由基的產生、穩定細胞膜和溶酶體膜、改善和疏通微循環等作用,對重要器官缺血再灌注損傷發揮保護作用[12]。實驗結果顯示,山莨菪堿能減輕ANI組肝臟病理改變和降低血清AST、ALT、TNF-α和IL-6含量,表明山莨菪堿對缺血再灌注的肝臟具有保護作用。山莨菪堿是否對HIRI過程中多器官損傷具有保護作用,目前還沒有報道。因此,本實驗首先建立70%肝臟缺血再灌注損傷大鼠模型,探討山莨菪堿預處理對大鼠肝缺血再灌注誘發多器官損傷的保護作用。

本研究參照文獻[13,14]確定山莨菪堿劑量為2 mg/kg進行預處理,實驗結果顯示,與IR組比較,ANI組肝、肺、腎和回腸組織病理改變較IR組輕,ANI組血清AST、ALT、BUN、CRE、TNF-α和IL-6含量及肝、肺、腎和回腸組織MDA含量、MPO活性顯著降低,SOD活性顯著升高。表明山莨菪堿預處理不僅能減輕肝臟缺血再灌注后肝臟本身功能受損,還能減輕肺、腎和回腸功能損傷,抑制氧化應激反應和炎癥因子的釋放,對肝臟和遠隔器官都具有一定的保護作用。

綜上所述,山莨菪堿預處理可減輕大鼠肝缺血再灌注誘發的多器官損傷,其機制可能與其抑制氧化應激反應、抑制過度炎癥反應有關。但肝缺血再灌注多器官損傷是一個多環節構成、多因素參與的復雜過程,是否存在其他方面的因素,有待進一步研究。