DNA修復相關蛋白RAD51在宮頸癌細胞增殖中的作用

盧曉寧,丁沐陽,李岐佩,馮曉珊,李 牧,吳曉玲

(西安交通大學第二附屬醫院婦產科,西安 710004;#共同第一作者;*通訊作者,E-mail:wxlxjtu07@sina.com)

宮頸癌(cervical cancer)是威脅全球女性健康的第三大惡性腫瘤,居女性生殖道惡性腫瘤之首[1]。雖然宮頸癌的發生與高危型人乳頭瘤病毒(human papilloma virus,HPV)的感染密切相關[2],但并非所有感染HPV者都會發展成為宮頸癌。多種分子功能紊亂,包括致癌基因的激活和抑癌基因的抑制等遺傳因素,以及多種環境因素的影響,都與宮頸癌的發生發展密切相關[3,4]。因此,當DNA受到損傷時,細胞會啟動多種復雜的信號通路進行修復,而當體內修復DNA的機制出現異常時,常會導致基因組的不穩定和腫瘤的發生。DNA修復機制在腫瘤的發生、發展中均具有十分重要的作用,在腫瘤學研究中倍受關注。雖然宮頸癌的發生機制尚未完全闡明,但其發生與DNA的損傷修復密切相關。

RAD51蛋白是在哺乳動物細胞中發現的第一個同源重組(homologous recombination,HR)修復相關蛋白,是體內催化同源重組性DNA修復最主要的關鍵酶[5]。RAD51蛋白可以促進DNA鏈的結合與DNA末端的多聚化,使核蛋白絲互補到DNA缺口同源鏈末端,介導其轉移與退火。研究發現,多種人類腫瘤中存在RAD51蛋白的高表達,包括宮頸癌[6]、非小細胞肺癌[7]、乳腺癌[8]、卵巢癌[9]、胰腺癌[10]等。RAD51參與了一個復雜的網絡,包括DNA損傷、細胞周期、凋亡調節、基因突變及蛋白異常表達[11]。RAD51蛋白過表達可改變重組途徑,使染色體發生重排,導致異常核型表達,這與其致瘤性密切相關,并進一步加強腫瘤的化療耐藥。RAD51基因敲除小鼠在胚胎期即表現為生長停滯,并在細胞內出現大量斷裂的染色體[12]。RI-1是RAD51的小分子抑制劑,通過與RAD51蛋白319位半胱氨酸共價結合來抑制RAD51蛋白與單鏈DNA分子的結合,從而影響同源重組修復[13]。因此,本研究將探討RAD51對宮頸癌細胞增殖的作用,為宮頸癌的臨床治療提供指導,為RAD51抑制劑類藥物的應用提供新的理論依據。

1 材料與方法

1.1 細胞與細胞培養

人類宮頸癌細胞株(Caski、C33a、HeLa、SiHa)購買于美國ATCC公司,C33a、HeLa、SiHa培養于DMEM培養基中(美國Sigma公司),CaSki培養于含10%的胎牛血清(美國Invitrogen公司)的RPMI-1640培養基中(美國Sigma公司)。所有細胞均培養在恒溫37 ℃、5%的CO2培養箱中。

1.2 標本采集

64例宮頸鱗狀細胞癌組織(SCC)均采集自2010-07～2015-01期間于西安交通大學第二附屬醫院婦產科宮頸癌住院患者,43例正常宮頸組織(NC)來自于同時期住院的子宮肌瘤子宮全切患者,采集程序均符合醫學倫理實踐的要求。標本采集前所有病人均未接受過放療、化療或免疫治療。組織學分類及臨床分期均與國際婦產聯盟的分類系統一致。所有標本均經查閱病例資料并由本院病理醫師復閱HE切片證實。

1.3 免疫組化

所有標本均經甲醛固定,常規石蠟包埋,連續切片4張,貼附于經多聚賴氨酸處理的載玻片上。經脫蠟水化,抗原修復,30 ml/L過氧化氫封閉后,加入一抗(anti-RAD51,1 ∶100,美國bioscience公司)4 ℃孵育過夜。次日加入二抗37 ℃孵育30 min,加入顯色劑顯色。磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對照。RAD51免疫染色采用半定量免疫反應評分(IRS):按染色強度和細胞數目進行分級。無著色為0,淡黃色為1,黃色為2,深黃色為3;陽性細胞數占細胞總數<10%為0,10%-25%為1,25%-50%為2,50%-75%為3,>75%為4,兩項相乘結果為總評分,大于3為陽性。

1.4 蛋白免疫印跡實驗(Western blot)

用pH為7.4的PBS重懸指數生長期的細胞,用胰酶(Roche公司)消化,用BCA法測定提取蛋白濃度,取等量的蛋白質樣品用10%的SDS/PAGE電泳,電轉移至PVDF膜,5%脫脂牛奶室溫封膜1 h,分別加入抗體:RAD51(1 ∶1 000,Bioscience公司),GAPDH(1 ∶1 000,Santa Cruz公司),cyclin D1(1 ∶500,Santa Cruz公司),P21(1 ∶500,Santa Cruz公司),4 ℃過夜,TBST洗膜,加入相應的辣根過氧物酶標記的二抗,室溫孵育2 h,TBST洗膜,ECL化學發光顯色系統顯色。以GAPDH為內參。

1.5 細胞生長與MTT實驗

以5×104細胞的密度種植于35 mm培養皿中,每皿加2 ml培養基,37 ℃常規培養7 d。采用紅細胞計數板進行細胞計數,每隔1 d計數一次,連續7 d,并繪制細胞生長曲線(每次實驗每組設置3個復孔,實驗均重復3次)。細胞活力實驗采用MTT分析法,將各細胞(8×102/孔)種植在96孔板上,常規培養,每隔1 d取出加入MTT溶液(5 mg/ml)20 μl,37 ℃繼續孵育4 h,終止培養。棄上清,每孔加入150 μl的DMSO,震蕩10 min,活細胞數量用分光光度計測定各孔在490 nm的吸光度值,根據結果繪制細胞生長曲線(每次試驗每組設置6個復孔,實驗重復3次)。

1.6 裸鼠成瘤實驗

取指數生長期的細胞(1×107)溶解在200 μl的PBS中,皮下注射在4-6周齡的雌性BALB/c裸鼠(上海SLAC公司)背部。移植瘤的體積用V=ab2/2(a為長,b為寬)計算。為了研究RAD51抑制劑RI-1的作用,當移植瘤面積增長至120 mm3時,開始每3 d記錄1次腫瘤的體積,每隔一天同時腹腔注射RI-1(5 mg/kg,溶解于200 μl的PBS)給裸鼠(n=6)。對照組腹腔注射等體積生理鹽水(n=6)。整個動物實驗操作流程被西安交通大學醫學院動物保護與使用委員會批準。實驗結束,處死裸鼠,完整取出移植瘤并稱重記錄。

1.7 流式細胞儀分析細胞周期

將對數生長期的各組細胞,經0.25%胰酶常規消化收集后,用70%冷乙醇4 ℃固定過夜,1 mg/ml的RNase A處理,20 μg/ml碘化丙啶(Sigma-Aldrich)4 ℃ 避光染色 30 min后,上流式細胞儀檢測。細胞周期分析用Mod-FitLT軟件分析。不同時間重復試驗至少3 次以上。

1.8 統計學分析

2 結果

2.1 RAD51在正常宮頸組織與宮頸上皮癌組織中的表達

正常宮頸組織中RAD51陽性率為13.95%(6/43),明顯低于宮頸癌組織中的73.44%(47/64)(P<0.01,見圖1)。免疫組化染色半定量免疫反應評分(IRS)提示,RAD51在正常宮頸組織中的表達評分為1.6,宮頸癌中明顯升高至6.8(P<0.01,見圖2),提示RAD51蛋白高表達與宮頸癌的發生有關。

進一步的Western blot結果顯示,RAD51在不同的宮頸癌細胞株中表達水平不同,RAD51在HeLa和SiHa細胞中表達水平較高(見圖3)。

2.2 RAD51對宮頸癌細胞增殖的影響

與對照組(DMSO處理組)相比,經10 μmol/L RI-1處理24 h后的HeLa和SiHa宮頸癌細胞中RAD51蛋白的表達幾乎完全被抑制(見圖4)。細胞生長與MTT實驗結果顯示,與對照組(DMSO處理組)相比,隨著時間延長,RI-1實驗組即RI-1明顯抑制了宮頸癌細胞HeLa(見圖5A、B)和SiHa(見圖5C、D)的生長速度及細胞活性,于培養第7天時各組與對照組間差異均有統計學意義(P<0.001,見圖5),提示其抑制作用具有時間依賴效應。

圖1 RAD51在正常宮頸和宮頸癌組織中的表達 (×100)Figure 1 The expression of RAD51 in normal cervix and cervical carcinoma specimen (×100)

圖2 RAD51在正常宮頸和宮頸癌組織中的IRS評分Figure 2 IRS of RAD51 staining in normal cervix and cervical carcinoma tissues

2.3 RAD51促進宮頸癌移植瘤的生長

裸鼠移植瘤生長曲線圖(圖6A)顯示,各組種植瘤持續生長,未出現致瘤裸鼠死亡,第36天時拍照記錄并處死裸鼠獲取腫瘤。與對照組相比,RI-1處理組腫瘤生長曲線緩緩上升,生長速度明顯低于對照組,差異具有統計學意義(F=16.93,P<0.001)。終點時間為第36天,與對照組種植瘤質量相比,RI-1實驗組移植瘤的平均質量顯著減小[(0.776±0.438)gvs(0.392±0.254)g,P<0.01,圖7A]。為了排除細胞特異性,也在SiHa細胞中實施成瘤實驗,并得到了類似的結果(F=11.69,P<0.001,圖6B;P<0.01,圖7B)。以上結果提示RAD51抑制劑RI-1抑制了宮頸癌細胞體內移植瘤的生長。

圖4 RAD51抑制劑RI-1的RAD51蛋白的影響Figure 4 The effect of RI-1 on RAD51 expression in HeLa and SiHa cells

2.4 RI-1處理后降低宮頸癌細胞中細胞周期蛋白cyclin D1和增加P21的表達

為了探索RI-1調節抑制宮頸癌細胞增殖的機制,我們采用流式細胞儀對 RI-1處理過的HeLa及SiHa與各自的對照組進行細胞周期分析實驗。實驗結果提示,S期的細胞從對照組HeLa-DMSO的47.25%下降至實驗組HeLa-RI-1的31.56%(P<0.05,見圖8),用SiHa細胞實驗得到同樣類似的結果(P<0.05,見圖8)。實驗結果提示,RAD51抑制劑RI-1可能阻止細胞周期G1/S期的轉換,抑制宮頸癌細胞的增殖。Western blot實驗顯示,RI-1處理48 h后,cyclin D1蛋白表達水平下調,P21蛋白表達水平上調(P<0.01,見圖9)。綜上結果,RAD51表達抑制可以改變蛋白cyclin D1與P21的互相作用進而阻斷細胞周期的轉換。

3 討論

宮頸癌是婦科常見惡性腫瘤之一,腫瘤的復發與轉移是導致臨床宮頸癌患者死亡的首要原因。因此,如何減少腫瘤的復發和轉移、延長患者的生存期及提高患者的生活質量是需要解決的關鍵問題。目前研究認為,宮頸癌的發生發展是多基因參與、多階段發展的病理過程,涉及眾多原癌基因的激活及抑癌基因的異常。基因組不穩定性(genomic instability)是腫瘤細胞的共同特征,表現為DNA損傷修復機制的異常和細胞周期調控紊亂[14]。

與相應DMSO比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001圖5 RI-1處理HeLa細胞或SiHa細胞后細胞生長速度和吸光度的變化Figure 5 Cell growth and MTT assays in HeLa cells and SiHa cells after treated with RI-1

圖6 RI-1抑制HeLa和SiHa細胞裸鼠移植瘤的生長Figure 6 RAD51 inhibitor RI-1 suppresses the growth of xenografts in HeLa and SiHa cells in vivo

圖7 RI-1對宮頸癌細胞移植瘤質量的影響Figure 7 The effect of RI-1 on the xenografts weight in cervical cancer cells

RAD51基因是一個通過同源重組介導DNA雙鏈斷裂修復的基因,是維持基因穩定性的重要因子。RAD51蛋白參與了一個復雜的網絡體系,包括DNA損傷傳感、細胞周期、凋亡調節、基因突變及蛋白異常表達等[15]。研究發現,多種人類腫瘤中存在RAD51蛋白的過表達現象。RAD51蛋白過表達可改變重組途徑,使染色體發生重排,導致異常核型表達,這與其致癌性密切相關,并誘導腫瘤細胞產生耐藥性[16]。因此,可以通過RAD51反義寡核苷酸,RNA干擾,核酸適配體,或者小分子抑制劑等方法使RAD51蛋白的表達水平下調或抑制RAD51蛋白的表達,從而增強腫瘤的化療敏感性[17]。最近的研究提示,在非小細胞肺癌中,RAD51的3′非編碼區直接連接miRNA34a后,可以調節基因的同源重組并且抑制了雙鏈DNA的修復[18]。

與相應DMSO比較，*P<0.05圖8 RI-1對HeLa和SiHa細胞周期的影響Figure 8 Effect of RI-1 on cell cycle of HeLa cells and SiHa

圖9 Western blot 檢測RI-1對細胞周期蛋白cyclin D1和P21蛋白表達的影響Figure 9 The effect of RI-1 on the expression levels of cell cycle-related protein cyclin D1 and P21 by Western blot

本研究結果表明,與正常宮頸組織相比,RAD51蛋白的表達水平在宮頸癌組織中明顯升高,這與之前對非小細胞肺癌[7]、乳腺癌[8]、前列腺癌[19]等研究結果相一致。隨后,本研究用RAD51抑制劑RI-1進一步驗證RAD51在宮頸癌發生發展中的作用,結果證實RI-1可特異性抑制RAD51蛋白活性。既往研究提示,在非小細胞肺癌的體外實驗中,二甲胺四環素(minocycline)與絲裂霉素(MMC)的結合可以協同抑制細胞增殖并且可以減少細胞活性[20]。本研究用RI-1抑制RAD51表達水平后,明顯抑制體外宮頸癌細胞及體內腫瘤組織的生長,這與之前的研究結果也一致。

p21基因是一種位于p53基因下游的細胞周期素依賴性激酶抑制因子,能通過同p53相互作用或抑制CDK2/4復合物達到調控細胞周期的目的。相關研究證實,P21與多種腫瘤的分化、增殖、浸潤程度及轉移情況等均有密切關系,非小細胞肺癌、胃癌、宮頸癌等癌灶組織內均可見P21表達異常情況[21]。cyclin D1蛋白可以調節細胞周期,促進腫瘤細胞的分化、增殖,抑制腫瘤細胞凋亡[22],從而促進腫瘤組織的浸潤和轉移,以及腫瘤組織內血管形成,導致病情進展。本實驗用流式細胞儀檢測了細胞周期的改變,結果提示RAD51抑制劑RI-1可以阻止宮頸癌HeLa和SiHa細胞從G0/G1至S期的轉換,并且RI-1可以使P21蛋白表達水平明顯增高,并使cyclin D1蛋白表達水平明顯降低。RAD51與P21、cyclin D1蛋白之間的關系值得進一步研究。

本研究提示的RAD51與宮頸癌發生發展的關系對于宮頸癌的治療具有深遠意義。本實驗證實,RAD51的表達水平的抑制確實可以抑制宮頸癌細胞的生長增殖及瘤體的形成。因此,RAD51可能成為治療宮頸癌的潛在靶點,深入了解RAD51在宮頸癌發生、發展及侵襲中的作用,對尋求治療宮頸癌的新方法有重要意義。