黃芩素聯合順鉑對乳腺癌細胞MCF-7增殖和凋亡的影響

蔣國君,劉亞明,王道鑫,趙婉晨,童旭輝

(安徽省生化藥物工程技術研究中心,蚌埠 233030;*通訊作者,E-mail:bbmctxh@126.com)

乳腺癌是嚴重危害女性健康的惡性腫瘤之一,其發病率位居女性惡性腫瘤的首位,并以每年2%的速度遞增[1]。目前乳腺癌的治療措施以手術為主,配合化學、內分泌及免疫治療[2]。順鉑是治療實體腫瘤的經典藥物,但近年來在臨床上的應用受限,主要原因是患者長期使用順鉑后,腫瘤細胞對其產生耐藥性[3]。黃芩素屬于天然的黃酮類化合物,有研究表明,黃芩素可以抗腫瘤,如抑制肝癌細胞、前列腺癌細胞等增殖[4]。本課題組前期研究也表明,在正常睪丸支持細胞中,低劑量的黃芩素可以增加順鉑的毒性[5]。那么,黃芩素是否也可以增強腫瘤細胞對化療藥物的敏感性呢?因此,本研究采用對乳腺癌MCF-7細胞無毒的黃芩素濃度聯合順鉑誘導MCF-7的增殖及凋亡,觀察對順鉑抗乳腺癌作用的影響,并且初步探討其機制,以期為順鉑在臨床的擴大應用提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 細胞株及主要試劑

細胞系MCF-7(購于中國科學院細胞庫)。MEM培養基(Gibco公司,美國),胎牛血清(四季青公司),順鉑(Cisplatin)、胰蛋白酶(Typsin)、MTT、二甲基亞砜(DMSO)均購于Sigma公司(美國),BCA蛋白定量試劑盒(碧云天公司),兔抗人Bcl-2抗體,兔抗人Bax抗體,鼠抗人β-actin(abcam公司，英國)。

1.2 細胞培養

人乳腺癌細胞MCF-7采用MEM高糖培養基,含有10%胎牛血清,100 U/ml青霉素,100 mg/L鏈霉素,37 ℃、飽和濕度、5% CO2培養箱中培養。細胞常規培養于培養瓶中,0.25%胰蛋白酶溶液消化傳代,1周傳代2-3次,傳代比例約為1 ∶3。

1.3 MTT法檢測細胞存活率

將細胞按5×105/ml的細胞密度接種于96孔板,每孔200 μl,每組藥物濃度設5個復孔,另設陰性對照組(不加順鉑或黃芩素)和空白對照組(不加細胞,只加培養基)。黃芩素濃度為0,10,20,40,80,160 μmol/L,順鉑濃度為0,1.25,2.5,5.0,10.0,20.0 μmol/L。加藥后24 h終止培養,終止培養前4 h,每孔加MTT(5 g/L)20 μl,棄上清液,加入二甲基亞砜(DMSO)200 μl/孔,細胞培養箱內孵育30 min,微量振蕩器震搖10 min,全自動定量繪圖酶標儀測定每孔的495 nm波長處吸光度A值。計算細胞存活率及順鉑作用于細胞24 h的IC50值。

1.4 溴化丙啶法檢測細胞早期凋亡

取對數生長期細胞以1.0×105/ml的密度接種于12孔板,第2天給藥,藥物分組如下:空白對照組、順鉑單用組、順鉑+黃芩素組。繼續培養12 h,收集細胞,加入1 ml冰乙醇固定,置于4 ℃冰箱內過夜。流式細胞儀檢測前采用溴化丙啶染色液對細胞染色,檢測細胞凋亡率。

1.5 Hoechst33258染色法檢測細胞晚期凋亡

將細胞以1.0×105/ml的密度接種于6孔板,第2天給藥。藥物分組如下:空白對照組、順鉑單用組、黃芩素單用組、順鉑聯合黃芩素組。繼續培養48 h,棄原培養基,PBS洗1次。10%甲醛固定,棄固定液。PBS洗3次,每次5 min。每孔加入10 μg/ml的Hoechst33258染色液1 ml,避光染色20 min。PBS洗3次,每次5 min,棄PBS,倒置熒光顯微鏡下觀察。

1.6 Western blot檢測細胞Bcl-2和Bax的表達水平

將細胞以2.0×105/ml的密度接種于6孔板,第2天給藥。藥物分組如下:空白對照組、順鉑單用組、黃芩素單用組、順鉑聯合黃芩素組。繼續培養48 h。細胞裂解液冰上裂解30 min,提取細胞總蛋白,采用BCA蛋白定量試劑盒(參照說明書)測各組蛋白濃度,并且將各組蛋白調至濃度一致,與2×上樣緩沖液1 ∶1混合,100 ℃煮沸5 min使蛋白變性。取蛋白50 μg/組,8% SDS-PAGE(60 V,30 min,120 V,120 min)分離蛋白;轉膜(50 V,150 min);5%封閉液室溫封閉2 h,搖床上孵育;一抗4 ℃孵育過夜;TPBS洗滌3次×20 min;二抗室溫孵育2 h;TPBS洗滌3次×15 min;ECL發光試劑盒暗室發光、顯影、定影。Bio-Rad凝膠成像系統采集圖像。

1.7 統計學分析

實驗數據采用SPSS13.0軟件進行分析,實驗數據采取均數±標準差表示,組間比較使用t檢驗,P<0.05表示差異具有統計學意義,圖標繪制采用Sigma Plot 10.0。

2 結果

2.1 順鉑和黃芩素對乳腺癌細胞MCF-7增殖抑制作用

本實驗分別采用不同濃度的順鉑和黃芩素作用于MCF-7細胞24 h,觀察細胞的存活率。實驗結果顯示,0,1.25,2.5,5.0,10.0,20.0 μmol/L順鉑刺激MCF-7細胞后,細胞存活率逐漸降低,且呈劑量依賴性(P<0.01)。經計算IC50為14 μmol/L。因此,本研究將采用7 μmol/L進行細胞凋亡檢測。

0,10,20,40,80,160 μmol/L黃芩素作用于MCF-7細胞24 h,細胞存活率逐漸降低(P<0.01),且20 μmol/L的黃芩素作用于細胞后,細胞存活率仍為99%(見圖1),可認為對細胞無毒性,因此,實驗將選擇20 μmol/L黃芩素聯合順鉑進行后續實驗。

與0 μmol/L比較，*P<0.05，**P<0.01圖1 順鉑和黃芩素對MCF-7細胞存活率的影響Figure 1 The survival rate of MCF-7 after treated with different concentrations of cisplatin and baicalein

2.2 黃芩素增強順鉑對MCF-7細胞的抗腫瘤作用

將藥物分為4組,分別為空白對照組、黃芩素組、順鉑組、黃芩素+順鉑組。黃芩素濃度為20 μmol/L,順鉑濃度為10 μmol/L。本實驗首先采用MTT法檢測藥物對MCF-7細胞24 h存活率的影響。結果顯示,10 μmol/L順鉑作用于MCF-7細胞24 h細胞存活率為(58.42±0.04)%,黃芩素聯合順鉑作用于MCF-7細胞,細胞24 h存活率僅為(41.56±0.03)%,與單用順鉑組相比,差異有統計學意義(P<0.01,見圖2)。

與空白組比較,**P<0.01;與順鉑組比較,##P<0.01圖2 黃芩素聯合順鉑組的細胞存活率Figure 2 Cell viability of MCF-7 cells after treated with baicalin combined with cisplatin

2.3 黃芩素增強順鉑誘導MCF-7細胞凋亡的作用

為了明確在MCF-7細胞中黃芩素增強順鉑的抗腫瘤作用是否與增加細胞凋亡相關,實驗首先采用流式細胞術檢測12 h細胞凋亡率,結果顯示,黃芩素(20 μmol/L)聯合順鉑(7 μmol/L)組的細胞凋亡率顯著高于單用順鉑組[16.80±1.20)%vs(10.66±1.63)%,P<0.01,見圖3A]。

采用Hoechst33258染色法觀察藥物對細胞晚期凋亡(48 h)的影響。由圖3B可見,對照組和黃芩素組細胞胞核均勻淡染,胞膜完整,胞核形態呈橢圓型,而單用順鉑組和黃芩素聯合順鉑組細胞膜通透性增加,細胞核濃集、邊緣化,黃芩素聯合順鉑組細胞數明顯減少,甚至有細胞核碎裂。這表明,黃芩素增強順鉑細胞毒性的作用與其增強順鉑誘導MCF-7細胞的凋亡相關。

2.4 黃芩素聯合順鉑對MCF-7細胞Bcl-2和Bax蛋白表達的影響

實驗結果表明,黃芩素聯合順鉑后促凋亡蛋白Bax的表達顯著升高,抗凋亡蛋白Bcl-2的表達水平降低(P<0.01,見圖4)。這說明,黃芩素可以通過影響凋亡相關蛋白的表達從而增強順鉑的抗腫瘤活性。

3 討論

順鉑是臨床常用的抗腫瘤藥物,屬于細胞周期非特異性藥物,是多種腫瘤化療方案中的組成藥物,對肺癌、睪丸癌、卵巢癌等實體瘤都有很好的療效。但是長期單獨用藥后產生耐藥是目前限制順鉑在臨床使用的重要原因[6,7]。近年來,天然藥物與化療藥物聯用抗腫瘤的應用成為研究熱點。黃芩素是從中藥黃芩中提取的重要單體,屬于黃酮類化合物,是黃芩的主要有效成分之一。許多研究表明,黃芩素可以抑制多種腫瘤細胞(如人肝癌細胞、人乳腺癌細胞、前列腺癌細胞等)的增殖,影響細胞周期分布,誘導細胞凋亡[8,9]。本實驗也證明,黃芩素單獨應用有一定的抗乳腺癌作用,且隨著濃度的增加,抗腫瘤作用增強。

圖3 黃芩素對順鉑誘導細胞凋亡的影響Figure 3 The influence of baicalein on apoptosis of MCF-7 cells induced by cisplatin

與空白組比較,**P<0.01;與順鉑組比較,##P<0.01圖4 黃芩素聯合順鉑對MCF-7細胞中Bax和Bcl-2表達的影響Figure 4 The expression level of Bax and Bcl-2 in MCF-7 cells after treated with baicalein and cisplatin

本課題組前期研究表明,在正常睪丸支持細胞TM4中,低濃度的黃芩素(對細胞無毒)可以增強順鉑的細胞毒性[5]。在耐順鉑的肺癌細胞株A549/CDDP中,對細胞生長無影響的黃芩素濃度與不同濃度的順鉑聯用均可明顯增強順鉑對A549/CDDP的抗腫瘤作用[10]。本實驗首先采用MTT法初步驗證了0-160 μmol/L濃度的黃芩素作用于乳腺癌細胞MCF-7,在20 μmol/L黃芩素作用于細胞24 h后,細胞的存活率仍能夠達到99%。因此,后續聯合用藥的研究選擇了20 μmol/L的黃芩素濃度。

腫瘤細胞凋亡能力下降是非常重要的導致細胞過度增殖的原因[11]。在本實驗中,黃芩素可以增加順鉑的抗腫瘤作用,但是否是通過增加細胞凋亡來完成的呢?本研究采用碘化丙啶染色法及Hoechest33258染色法檢測了細胞的凋亡情況,研究表明,無論是早期凋亡還是晚期凋亡,黃芩素均可以增加順鉑誘導的MCF-7細胞的凋亡率,且結果有一定的顯著性。

Bcl-2是一種重要的凋亡調控基因,在多種惡性腫瘤的發生發展中起重要的調控作用。Bax是Bcl-2家族中的促凋亡成員,可促進細胞凋亡,Bax因與Bcl-2蛋白共同免疫沉淀而被鑒定[12,13]。Bcl-2與Bax蛋白的比率決定異二聚體(Bcl-2/Bax)與同二聚體(Bax/Bax)的比值,這對決定細胞凋亡的易感性起關鍵作用[14]。本實驗結果顯示,Bcl-2與Bax蛋白在乳腺癌MCF-7凋亡中表達水平發生了改變,在黃芩素聯合順鉑時,MCF-7細胞中Bcl-2的表達顯著降低,而Bax的表達上調,這表明,黃芩素通過增加Bax、降低Bcl-2的表達水平從而增強了順鉑的抗腫瘤作用。

綜上,本研究證實黃芩素在不影響細胞增殖的情況下可以明顯增加順鉑抗腫瘤的作用,其機制是通過上調Bax的表達和下調Bcl-2的表達,使Bcl-2/Bax比值減小,從而達到促進細胞的凋亡。本研究為順鉑的臨床應用提供了實驗基礎,也為擴大化療藥物的應用提供了一個良好的策略。