LncRNA LINC01152抑制乳腺癌細胞的侵襲能力

湯銳明,邱惠思,黃 巖,潘輝林,宋慧勝,王 馨,吳華振,馮正富

(廣州醫科大學附屬第六醫院,清遠市人民醫院放療科,清遠 511518;*通訊作者,E-mail:qyzhf@163.com)

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一,已成為當前社會的重大公共衛生問題[1]。近年來我國乳腺癌的發病率逐年上升,且上升趨勢明顯大于發達國家[2-4]。據國家癌癥中心和衛生部疾病預防控制局2012年公布的2009年乳腺癌發病數據顯示:全國腫瘤登記地區乳腺癌發病率已位居女性惡性腫瘤的第1位[5]。因此,闡述乳腺癌發病機制,控制乳腺癌發生率,提高乳腺癌治療效果,降低乳腺癌死亡率已成為亟待解決的重大課題。

隨著治療方式的改進,治療方案的調整,乳腺癌的治療效果有了很大的改善。調查統計顯示乳腺癌患者的5年生存率不斷提高,但遠期效果仍不確定且乳腺癌的侵襲轉移是患者死亡的前兆[6]。因此,闡明乳腺癌侵襲轉移的分子機制,篩選鑒定相關標志物,完善信號調控網絡,對于設計開發特異性靶向藥物,對于抑制侵襲轉移以提高乳腺癌治療效果具有重要的理論價值和應用前景。

LncRNA LINC01152(Ensemble ID:ENST00000472655.3),轉錄本長度為3 578 bp,無蛋白質編碼功能,屬于基因間lncRNA。通過基因表達分析數據庫(gene expression profiling interactive analysis,GEPIA)分析證實LINC01152在乳腺癌組織中的表達量顯著低于其在正常組織中的表達量,根據患者隨訪資料,制作生存曲線說明LINC01152的表達量與患者預后負相關。這些結果提示LINC01152可能在乳腺癌中發揮重要作用。本文在上述基礎上,擬重點探討LINC01152在乳腺癌中發揮的作用及LINC01152在乳腺癌中低表達的分子機制。

1 材料與方法

1.1 細胞株及主要試劑

人正常乳腺上皮細胞MCF-10A及乳腺癌細胞MCF-7、T47D、BT549、MDA-MB-231和SKBR3由清遠市人民醫院實驗中心保存。LINC01152過表達及干擾質粒均購自廣州復能生物有限公司。FOXO3a過表達及干擾質粒由清遠市人民醫院實驗中心保存。

10%胎牛血清、1640培養液、Trizol均購自美國Gibco公司。逆轉錄試劑盒、SYBR試劑購自美國Fermentas公司。定點突變試劑盒Mutant BEST購自日本TaKaRa公司。RIPA溫和裂解液購自碧云天生物有限公司。Dual-luciferase report assay試劑盒購自美國Promega公司。

1.2 細胞培養

將乳腺癌細胞接種于含10%胎牛血清的1640培養液中,在37℃、5% CO2的培養箱中培養。MCF-10A細胞培養基配置:DMEM/F12(1 ∶1)培養基,馬血清(5%),依次加入胰島素(10 μg/ml)、表皮生長因子(20 ng/ml)、霍亂毒素(100 ng/ml)和氫化可的松(0.5 μg/ml),培養條件與MCF-7細胞一致。

1.3 RNA提取及逆轉錄

使用Trizol室溫裂解細胞5 min,加入氯仿萃取,靜置10 min,12 000g離心10 min。吸取水相加入異丙醇,室溫靜置10 min,12 000g離心10 min。棄廢液,沉淀用70%乙醇洗滌1次,12 000g離心5 min。棄廢液,風干,加入30 μl超純水,-80 ℃保存備用。

按照說明書配置逆轉錄體系:RNA 2 μg,Random Primer 1 μl,水補足12 μl。65 ℃ 5 min,立即冰置2 min。加入4 μl Reaction Buffer,1 μl RNase inhibitor,2 μl dNTP,1 μl Reverse trscriptase。42 ℃ 1 h,70 ℃ 5 min。-20 ℃保存該cDNA。

1.4 實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)

按照說明書配置qRT-PCR反應體系,隨后在BioRad熒光定量儀上運行該程序:50 ℃ 2 min,95 ℃ 2 min,95 ℃ 15 s,60 ℃ 30 s(40個循環)。根據2-ΔΔct值計算相對表達量。其中引物序列見表1。

1.5 構建報告基因載體

根據定點突變試劑盒說明書操作,構建野生型和缺失型報告基因載體,并將陽性克隆送至華大基因有限公司測序,野生型和缺失型報告基因載體分別命名pGL4-wt-LINC01152和pGL4-del-LINC01152。引物見表1。

表1 所用的引物序列Table 1 Primer sequences used in this study

小寫字母表示限制性內切酶位點

1.6 免疫印記實驗(Western blot,WB)檢測FOXO3a的表達

RIPA裂解目標細胞,采用BCA法測定蛋白濃度。35 mg上樣量將目標蛋白置于點樣孔,待電泳結束,將其轉移至PVDF膜上,5%牛奶封閉2 h,一抗(FOXO3a,1 ∶1 000;β-actin,1 ∶5 000)4 ℃孵育過夜,HRP偶聯的辣根過氧化酶二抗孵育2 h,采用BioRad公司的ECL進行化學發光。

1.7 雙熒光素酶報告基因實驗

將目標細胞接種96孔板,使用Lipofectamine 3000進行脂質體轉染。轉染48 h后,按照試劑盒說明書操作,對上述細胞行雙熒光素酶報告基因檢測。每個孔熒光素酶活性=螢火蟲熒光素酶活性/海腎熒光素酶活性。

1.8 細胞侵襲實驗

購買Corning的Transwell小室,將其用1% FBS的培養基水化30 min。在此期間,消化細胞,并用1% FBS的培養基重懸細胞且計數。將2×106細胞/ml的目標細胞接種200 μl于小室上層,小室下層加入600 μl完全培養基。細胞接種24 h后,將小室直接放入甲醇中室溫固定20 min,吸取小室上層培養基,并用棉簽小心擦拭上層。將小室放入1%結晶紫中室溫染色10 min,流動水沖洗小室,晾干水分,拍照并計數。

1.9 統計學分析

2 結果

2.1 LINC01152在乳腺癌中低表達且與患者較差的預后負相關

通過數據庫GEPIA統計后證實LINC01152在1 085例乳腺癌組織中的表達量顯著低于其在291例癌旁組織中的表達量(P<0.05,見圖1)。同時在528例高表達LINC01152的乳腺癌患者和528例低表達LINC01152的乳腺癌患者中進行預后分析,結果提示LINC01152高表達的患者預后較好,而LINC01152低表達的患者預后較差(見圖2)。此外,在乳腺癌細胞和正常乳腺上皮細胞中檢測LINC01152的表達量,結果顯示LINC01152在乳腺癌細胞中的表達量顯著低于正常乳腺上皮細胞(見圖3)。

圖1 LINC01152在乳腺癌組織和正常組織中的表達量Figure 1 Comparison of LINC01152 expression between breast cancer tissues and normal tissues

圖2 LINC01152對乳腺癌患者預后的影響Figure 2 Effect of LINC01152 on prognosis of breast cancer patients

2.2 FOXO3a轉錄上調LINC01152

為了尋找LINC01152在乳腺癌中低表達的原因,首先通過在線軟件JASPAR預測到LINC01152啟動子上存在轉錄因子FOXO3a結合位點(見圖4)。其次在BT549細胞中過表達FOXO3a,qRT-PCR結果發現FOXO3a可顯著上調LINC01152的表達;在MCF-7中敲低FOXO3a,qRT-PCR結果證實LINC01152的表達量明顯降低(見圖5)。最后,在HEK-293T中過表達FOXO3a可明顯上調野生型LINC01152的啟動子活性,但是對缺失型LINC01152的啟動子活性無影響(見圖6)。

與MCF-10A比較，**P<0.01圖3 LINC01152在多種乳腺癌細胞中的表達Figure 3 The expression of LINC01152 in breast cancer cells

2.3 LINC01152抑制乳腺癌細胞侵襲能力

在BT549細胞中過表達LINC01152,在MCF-7細胞中敲低LINC01152,并用qRT-PCR技術檢測過表達及干擾效果(見圖7)。此外,Transwell結果顯示在BT549中過表達LINC01152,該細胞的侵襲能力較對照組顯著下調。相反的,在MCF-7細胞中敲低LINC01152,該細胞的侵襲能力較對照組顯著增加(見圖8)。

圖4 FOXO3a對LINC01152啟動子調控作用的預測Figure 4 Prediction of FOXO3a regulating LINC01152 promoter

A. BT549細胞LINC01152表達 B. MCF-7細胞LINC01152表達圖5 FOXO3a對LINC01152表達的影響Figure 5 Effect of FOXO3a on expression of LINC01152 in BT549 and MCF-7 cells

圖6 HEK-293T中FOXO3a對LINC01152啟動子活性的影響Figure 6 Effect of FOXO3a on promoter activity of LINC01152 in HEK-293T cells

3 討論

已有的研究表明lncRNA表達或功能異常與人類疾病的發生密切相關,其中就包括癌癥、退行性神經疾病在內的多種嚴重危害人類健康的重大疾病[7-11]。因此本文首先根據數據庫資料統計證實LINC01152在乳腺癌組織中的表達量顯著低于其在正常組織中的表達量。在細胞層面,LINC01152在乳腺癌細胞中的表達量亦顯著低于乳腺正常上皮細胞。這些結果提示LINC01152在乳腺癌發生發展中可能發揮抑癌作用。與此相類似的是,有學者證實LINC01152在45例肝癌組織中的表達量顯著高于其在18例癌旁組織中的表達量[12]。LINC01152最初是在患有增生癥患者體內發現的lncRNA,目前僅證實LINC01152可能在人間質干細胞的軟骨分化過程中發揮作用[6],關于其在腫瘤中的作用尚未有具體的闡明[13]。因此我們在乳腺癌細胞中通過過表達和敲低LINC01152的表達,分析其對乳腺癌細胞生物學行為的影響。研究表明過表達LINC01152可顯著降低乳腺癌細胞的侵襲能力,而敲低LINC01152后乳腺癌細胞的侵襲能力大大提高。

圖7 在乳腺癌細胞中不同干預后LINC01152的表達Figure 7 LINC01152 expression after different treatment in breast cancer cells

圖8 LINC01152對乳腺癌細胞侵襲能力的影響Figure 8 Effect of LINC01152 on invasion of breast cancer cells

LncRNA功能的發揮與其在腫瘤中的異常表達是分不開的。因此,我們重點探討LINC01152在乳腺癌中低表達的分子機制。生物信息學預測LINC01152啟動子上存在轉錄因子FOXO3a的結合位點。FOXO3a,又名FOXO3,是forkhead box(FOX)蛋白家族的一個重要成員[14]。FOX蛋白家族包含功能各異的轉錄因子,每個成員都含有一個高度保守的DNA結構域(即FOX結構域)[15,16]。研究表明,FOXO3a通過上調凋亡前基因Bim和p27Kip1及上調腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(tumornecrosis factor-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)發揮抑癌作用[17]。我們采用同樣的方法,用雙熒光素酶報告基因實驗證實LINC01152的轉錄受到抑癌因子FOXO3a的調控。

總之,我們依據上述的結果,針對乳腺癌發生發展調控機制提出以下觀點:即FOXO3a可能通過上調LINC01152的表達從而抑制乳腺癌細胞的侵襲能力。