不同劑量中波紫外線對原代角質形成細胞增殖和自噬的影響

宋健文,黃惠梅,張 英,王 博

(1西安市兒童醫院皮膚科,西安 710003;2西安市兒童醫院腎臟科;3西安交通大學第一附屬醫院消化內科;4西安交通大學第一附屬醫院轉化醫學中心;5陜西省腫瘤精準醫學重點實驗室;*通訊作者,E-mail:realwbo@163.com)

自噬是真核細胞中廣泛存在的自我保護機制,主要功能是降解蛋白質和細胞器以及保持細胞內環境穩定性以適應細胞外各種環境壓力和刺激,故自噬也是細胞自我更新的基本途徑[1]。雖然自噬是細胞內基本的生理現象,但已有的研究充分表明,自噬在炎癥反應中發揮著重要的作用,特別是過度的自噬反應可能誘導炎性疾病的發生發展,例如感染性疾病,代謝性疾病和自身免疫性疾病等[2,3]。因此,研究自噬在疾病發生發展的機制,有利于疾病發病機制研究以及為臨床治療靶點的篩查提供新思路。

目前,紫外線過度照射對皮膚造成的損傷也越來越受到人們的重視。紫外線過度照射的損傷對象包括皮膚的各個組成部分,其中中波紫外線(ultravio-let B,UVB)主要作用的靶部位是角質形成細胞(keratinocyte)。UVB可能是通過DNA損傷、部分信號通路的異常以及炎癥反應的產生等形式對皮膚造成損傷[4-6]。UVB可誘導角質形成細胞產生一系列炎癥細胞因子,通過炎癥細胞因子UVB可參與皮膚內環境細胞損傷、修復、增殖和凋亡等過程[7,8]。而UVB誘導炎癥反應的過度激活,可能通過自噬反應發揮作用,故本研究通過不同劑量UVB照射原代角質形成細胞,檢測UVB對角質形成細胞增殖和自噬的影響,再通過自噬抑制劑和促進劑處理細胞觀測UVB照射角質形成細胞后對其存活率的影響,最終確定不同劑量中波紫外線對原代角質形成細胞增殖和自噬的影響。

1 材料和方法

1.1 主要試劑及儀器

RPMI 1640培養基購自美國Hyclone公司;小牛血清購自中國四季青公司;0.25%胰酶,限制性KC-FSM培養基購自美國Gibico公司;dispase酶,雷帕霉素,氯喹購自美國Sigma-Aldrich公司;兔抗人LC3和GAPDH多克隆抗體購自英國Abcam公司;HRP標記羊抗兔Ig G抗體購自北京博奧森生物技術有限公司;ECL試劑盒購自美國Pierce公司;SUV-1000日光紫外線模擬器購自中國上海希格瑪高技術有限公司。

1.2 原代細胞株及主要試劑

取新切除的包皮組織，用含有青霉素100 U/ml和鏈霉素100 U/ml的PBS清洗3次，剪除皮下脂肪組織，并將皮膚組織剪成0.5 cm×0.5 cm大小的組織塊，用0.5% dispase酶在4 ℃消化過夜；分離表皮和真皮，表皮中加入0.25%胰酶(含0.2% EDTA)置于37 ℃中消化10 min，用含10%小牛血清的RPMI 1640培養基終止胰酶消化；200目濾網過濾細胞，2 000 r/min離心獲取細胞沉淀，用限制性KC-FSM培養基置于37 ℃，5% CO2培養。人皮膚原代角質形成細胞培養至少3代后用于實驗。

1.3 UVB照射細胞

按照5.0×105個細胞/孔的密度將人皮膚原代角質形成細胞接種于6孔板。當細胞密度達到80%-90%時,用日光紫外線模擬器進行UVB照射;每個孔照射時周圍用遮光紙完全遮蓋,對于UVB照射劑量共設4組:對照組(0 mJ/cm2),10 mJ/cm2,20 mJ/cm2和40 mJ/cm2組。UVB照射細胞后,根據實驗時間點收集細胞用于后續實驗或直接用于下步檢測。

1.4 MTT法檢測細胞活力

不同劑量UVB照射細胞后12 h,每孔加入5 g/L的四甲基偶氮唑藍(MTT)100 μl,混勻后將細胞置于37 ℃培養箱避光孵育4 h。取出培養板將上清棄掉，加入2 ml的二甲基亞砜(DMSO)，室溫混勻10 min，待結晶全部溶解后通過全波長酶標儀在波長為490 nm處檢測各孔的A值(A值越高代表細胞活力越高)。

1.5 MDC染色法檢測細胞自噬表達陽性率

不同劑量UVB照射細胞后12 h,棄掉培養基,PBS漂洗1次,每孔加入50 μmol/L的單丹磺酰戊二胺(dansylcadaverine,MDC)200 μl,室溫避光孵育40 min,PBS漂洗3次,置于倒置熒光顯微鏡下于激發波長355 nm處觀察細胞自噬情況。綠色熒光代表自噬的發生,在倒置熒光顯微鏡下觀察到細胞質內出現3處以上高密度綠色熒光點,即判定為MDC染色陽性細胞。每個孔隨機選取5個視野,計數每個視野中總細胞數和MDC染色陽性細胞數,計算出細胞自噬表達陽性率。

1.6 氯喹和雷帕霉素預處理方法

按照1.3 UVB照射細胞實驗方法,將實驗分為對照組,氯喹處理組和雷帕霉素處理組。當細胞貼壁后,氯喹處理組給予1 μmol/L的氯喹處理,雷帕霉素處理組給予20 μmol/L的雷帕霉素處理,繼續培養24 h后,棄去培養基,PBS漂洗2次,隨后對細胞進行20 mJ/cm2的UVB照射,照射2 h MTT檢測細胞活力。

1.7 自噬相關蛋白的檢測

用含有蛋白酶抑制劑的蛋白裂解液(RIPA)在冰上裂解細胞提取蛋白。用BCA試劑盒定量提取蛋白質含量,并按照40 μg總蛋白上樣量SDS-PAGE分離蛋白。在12%分離膠中電泳后,將蛋白質從分離膠中轉移到PVDF膜上,用5%的脫脂奶粉對膜室溫封閉2 h。1 ∶1 000稀釋抗LC3和GAPDH抗體作為一抗,4 ℃孵育過夜。TBST漂洗,用1 ∶5 000稀釋的辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG抗體作為二抗,室溫孵育2 h。TBST漂洗,滴加ECL化學發光液進行發光,成像系統成像。

1.8 統計學分析

2 結果

2.1 不同劑量UVB照射對角質形成細胞增殖的影響

為檢測UVB對角質形成細胞增殖的影響,選擇人皮膚原代角質形成細胞在接受不同劑量(0,10,20,40 mJ/cm2)UVB照射后12 h運用MTT法檢測細胞增殖活力。結果表明,隨著UVB照射劑量的增加,角質形成細胞的透明度明顯增加,細胞間隙明顯變寬,部分貼壁細胞失去正常貼壁形態變成圓形,同時漂浮的凋亡細胞數目顯著增加。MTT實驗結果顯示,隨著UVB照射劑量的增加,角質形成細胞的增殖活力具有降低趨勢(F=51.079,P<0.001),其中以0 mJ/cm2作為對照組,其余各組與對照組相比,細胞活力顯著下降,差異有統計學意義(P<0.01,見表1)。

表1 不同劑量UVB照射對角質形成細胞活力的作用Table 1 Keratinocyte viability after irradiation with different doses of

與對照組(0 mJ/cm2)比較,**P<0.01,***P<0.001

2.2 不同劑量UVB照射對角質形成細胞自噬表達陽性率的影響

同樣對人皮膚原代角質形成細胞進行不同劑量UVB照射后,MDC染色法檢測角質形成細胞自噬表達陽性率。結果表明,隨著UVB照射劑量的增加,角質形成細胞自噬表達陽性率顯著增加(F=2 148.2,P<0.001),其中以0 mJ/cm2作為對照組,其余各組與對照組相比,細胞自噬表達陽性率顯著增加,但40 mJ/cm2組細胞自噬表達陽性率出現一定抑制,差異有統計學意義(P<0.001,見表2)。

表2 不同劑量UVB照射對角質形成細胞自噬表達陽性率的作用Table 2 Proportion of autophagosome-positive cells under different doses of UVB

與對照組(0 mJ/cm2)比較,***P<0.001

2.3 不同劑量UVB照射對角質形成細胞自噬相關蛋白表達的影響

人皮膚原代角質形成細胞經0,10,20,40 mJ/cm2UVB照射后,通過Western blot技術檢測自噬相關蛋白LC3的表達水平。結果表明,隨著UVB照射劑量的增加,角質形成細胞自噬相關蛋白LC3-Ⅱ表達水平逐漸升高，其中20 mJ/cm2和40 mJ/cm2組顯著增加(見圖1)。該部分結果說明不同劑量UVB照射可使角質形成細胞自噬水平明顯升高，其中20 mJ/cm2的UVB照射是自噬水平明顯增加的最低照射劑量，可選作后續實驗的照射劑量。

圖1 不同劑量UVB照射對人皮膚原代角質形成細胞自噬相關蛋白表達的影響Figure 1 Expression of autophagy-related proteins in human primary keratinocytes after exposed to different doses of UVB by Western blot

2.4 UVB照射后不同時間點對角質形成細胞自噬相關蛋白表達的影響

選擇20 mJ/cm2UVB照射人皮膚原代角質形成細胞后,在0 h,2 h,4 h和8 h不同時間點通過Western blot技術檢測自噬相關蛋白LC3的表達水平。結果顯示,20 mJ/cm2UVB照射角質形成細胞后,自噬相關蛋白LC3-Ⅱ表達水平先升高后降低，其中照射后2 h LC3-Ⅱ表達水平最高，隨后4-8 h逐漸降低(見圖2)。結果說明20 mJ/cm2UVB照射角質形成細胞后2 h，細胞自噬達到相對較高的水平。

圖2 UVB照射后不同時間點對人皮膚原代角質形成細胞自噬相關蛋白表達的影響Figure 2 Expression of autophagy-related proteins in human primary keratinocytes at different time points after UVB irradiation by Western blot

2.5 促進或抑制自噬對UVB照射角質形成細胞存活率的影響

將人皮膚原代角質形成細胞分別使用自噬抑制劑氯喹(chloroquine,CQ)和自噬促進劑雷帕霉素(rapamycin,RAPA)進行預處理,再對細胞進行20 mJ/cm2的UVB照射后2 h采用MTT實驗檢測細胞活力。結果表明,預先使用CQ和RAPA處理的人皮膚原代角質形成細胞后,照射2 h檢測細胞活力的A490值分別為：對照組0.895±0.022,氯喹處理組0.396±0.050,雷帕霉素處理組0.957±0.048。與對照組相比,雷帕霉素處理組細胞存活率具有增高的趨勢,而氯喹處理組細胞存活率顯著降低,差異有統計學意義(P<0.001,見圖3)。結果說明雷帕霉素有提高UVB照射后角質形成細胞存活率的趨勢,而氯喹可顯著降低UVB照射后角質形成細胞的存活率。

與對照組相比較,***P<0.001圖3 氯喹和雷帕霉素對UVB照射后人皮膚原代角質形成細胞存活率的影響Figure 3 Effect of chloroquine and rapamycin on the viability of human primary keratinocytes after UVB irradiation

3 討論

自噬是真核細胞自我吞噬的現象,是細胞通過溶酶體降解細胞內被損傷或是老化的蛋白和各種細胞器并再利用的過程,是細胞維持自身穩定并完成自我更新的重要防御機制[10]。自噬過程是一個高度保守的生物學過程,前期主要是細胞在氧化應激或饑餓等條件刺激下,內質網和高爾基體脫落的磷脂雙分子層膜通過延伸,將細胞內損傷或老化的細胞器和生物大分子吞噬包裹形成自噬小體;自噬小體通過細胞骨架微管系統運輸,再與溶酶體進行融合形成自噬溶酶體;由溶酶體中的各種相關酶將細胞器和生物大分子完成降解過程,并為機體產生能量,同時自噬小體也可以通過再回收和再利用的生物學過程來維持細胞內環境的穩定[11,12]。有多種細胞內信號通路以及自噬相關蛋白參與自噬的發生,例如自噬上游信號通路哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR),磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol 3 kinase)以及蛋白激酶B(protein kinase B,PKB),即PI3K-Akt-mTOR信號通路,同時還有自噬相關蛋白(autophage-related protein,Atg)家族分子以及微管相關蛋白輕鏈3(light chain 3,LC3),其中LC3-Ⅱ是由LC3-Ⅰ剪切而來,是自噬體形成的標志性分子,被廣泛用于檢測和定量評定細胞自噬的活性[13,14]。大量的研究表明,自噬在多種疾病中表現出異常的表達水平,且自噬相關基因的突變與感染,神經退行性疾病以及腫瘤密切相關[15]。

紫外線過度照射是人類皮膚損傷的重要因素之一。紫外線特別是中波紫外線,是外界環境中導致皮膚損傷和病理變化的主要因素。而角質形成細胞是皮膚中最為重要的一類細胞,UVB可通過DNA損傷、氧化應激和免疫抑制等對角質形成細胞造成損傷。所以深入研究UVB對角質形成細胞損傷的機制對相關皮膚病的預防和治療具有重要的意義和價值。目前,自噬在各種皮膚病中的作用機制研究日益受到皮膚學界學者的關注,特別是在黑色素瘤中自噬水平顯著高于良性的黑色素痣[16];也有研究在黑色素瘤中,自噬相關蛋白Bcelin 1表達的下調和疾病的進展呈正相關[17];黑色素瘤組織中自噬的水平與轉移性黑色素瘤患者低生存率密切相關,抑制自噬可使侵襲性黑色素瘤細胞凋亡[18]。國內也有報道,UVB對HaCaT細胞增殖活力的損傷有劑量依賴性,而原代角質形成細胞更耐受UVB損傷[19]。同時,目前已有大量文章對UVB誘導細胞凋亡進行了細致的研究,但自噬與UVB照射的機制研究相對較少[20,21]。如上所述,初步研究不同劑量UVB對原代角質形成細胞自噬的影響,可以為自噬在UVB光損傷疾病中機制研究提供基礎,也為臨床預防和治療提供新的理論依據。

本研究分離了人皮膚角質形成細胞,檢測了不同劑量UVB照射細胞后其增殖活力、細胞自噬表達陽性率和自噬相關蛋白的表達水平,而且觀察提前干預自噬檢測UVB對細胞存活率的影響，結果表明,原代角質形成細胞經10,20,40 mJ/cm2UVB照射后,細胞增殖活力顯著下降,自噬表達陽性率顯著增加且自噬相關蛋白LC3-Ⅱ表達水平逐漸升高;20 mJ/cm2UVB照射角質形成細胞2 h時LC3-Ⅱ表達水平最高,而4 h和8 h呈逐漸降低趨勢;使用自噬促進劑雷帕霉素預處理角質形成細胞有提高UVB照射后細胞存活率的趨勢,而自噬抑制劑氯喹可顯著降低UVB照射后細胞的存活率。本結果說明UVB照射可以對原代角質形成細胞起到抑制細胞增殖和促進自噬發生的作用,且抑制自噬可顯著降低UVB照射后細胞的存活率。本研究結果為深入研究UVB照射對原代角質形成細胞增殖和自噬的影響提供了具體細胞實驗的照射條件以及了解UVB與自噬的分子機制提供了新的出發點,但促進自噬是否可以部分緩解UVB照射對細胞的影響,以及自噬在其中發揮作用的具體分子機制,仍需要進一步的深入研究。