黃小雨,仲歡歡,付琳琳,董紅燕,董富興*

(1徐州醫科大學形態學科研實驗中心,徐州 221004;2徐州醫科大學病原生物學與免疫學教研室;*通訊作者,E-mail:fxdongxzmc@163.com)

冰凍切片是一種借助低溫環境,使組織在短時間內達到一定硬度而進行切片的方法。由于冰凍切片比石蠟切片相對省時且能較好地保護抗原活性,因此廣泛地應用于臨床病理快速診斷和科學研究[1]。在科學研究中,特別是在進行免疫組化和免疫熒光染色實驗前,需要將動物進行灌注固定,實驗人員尤其是剛入門的新手在制作冰凍切片過程中經常出現切片不完整、刀痕、冰晶、皺折等問題,制片難度相對較大。要制作出高質量切片,實驗人員除了熟練掌握切片方法,還需要注意實驗過程中的每一個細節。作者通過不斷實踐和積極探索,就冰凍切片各個環節中出現的常見問題及操作技巧介紹如下。

1 材料與方法

1.1 材料

恒溫式冰凍切片機(德國Leica,CM1950),BTl00-02型蠕動泵(保定齊力恒流泵有限公司),正置顯微鏡(日本Olympus,BX41);10%水合氯醛,4%多聚甲醛(0.1 mol/L PB溶液配置),生理鹽水,15%和30%蔗糖溶液(0.1 mol/L PB溶液配置),OCT包埋劑(美國Sakura公司)。

1.2 方法

1.2.1 灌注固定 取小鼠稱重,用10%水合氯醛(0.35 ml/100 g體質量)腹腔膜注射麻醉后固定于解剖手術臺,分離皮下組織,充分暴露胸腔,將灌注針(7#)插入左心室并送至升主動脈內,同時剪開右心耳,用蠕動泵依次灌注生理鹽水和4%多聚甲醛,其中前1/3量快速灌注(70 r/min),后2/3量緩慢灌注(50 r/min)。灌注結束后取心、肝、腎、脾、肺、腦6種組織,分別浸泡于4%多聚甲醛中,4 ℃后固定過夜后依次浸入15%和30%蔗糖溶液直至沉底。

1.2.2 冰凍切片 將組織從30%蔗糖溶液中取出,用濾紙吸去多余液體后,用OCT將組織包埋于鋁箔紙做成的圓柱體狀容器中,然后在-80 ℃冰箱中冷凍30 min,之后快速取出放于冰凍切片機箱體中復溫30 min后進行常規切片,切片厚度為10 μm,貼于黏附載玻片上,自然風干后進行下一步染色。

1.2.3 HE染色 將切片復水后置于蘇木素染液10 min,水洗2 min,用1%鹽酸乙醇分化15 s,水洗2 min,自來水返藍20 min,伊紅2 min,水洗1 min,90%乙醇30 s,95%乙醇5 min,100%乙醇5 min,二甲苯透明后中性樹膠封固,顯微鏡下觀察拍照。

2 結果

用以上方法對不同組織進行快速冰凍切片,結果顯示此方法切片完整、厚薄均勻、貼片平整、不易產生皺折及冰晶,鏡下組織結構清晰無皺褶,染色清晰,核漿對比度好,色彩鮮艷(見圖1)。

A.肝;B.脾;C.肺;D.腎;E.心;F.腦皮質圖1 不同組織的冰凍切片HE染色結果 (×40)

3 討論

冰凍切片制作過程相比石蠟切片更加便捷,因其能較好地保存抗原活性和組織結構,所以廣泛應用在科研和臨床病理診斷中。對于科研工作者,尤其是剛入門的“新手”,熟練掌握冰凍切片技術且制作出高標準的切片并非易事,冰凍切片的質量受多方面因素的影響,我們實驗室經過長期實踐主要從以下環節上加強質控。

3.1 灌注固定

良好的組織固定是防止組織細胞自溶與腐敗,保存細胞內蛋白質、脂肪、糖等各種成分的關鍵。本實驗采用蠕動泵進行灌注固定,它模擬了動物心跳動,固定效果好,染色效果佳且可操控性強[2]。灌注固定時操作要干脆利落,從開胸到進針的整個過程,時間盡量控制在3 min內,否則容易引起部分組織如腎、肺等出現凝血現象以及肝臟、腦等器官組織自溶。插灌注針時,未經處理的輸液管針頭過于鋒利易刺入右心房,操作過程中也會出現針頭滑脫問題。為了避免這些現象,我們將針頭剪除針尖,進針時動作輕慢有突破感即止,針頭方向略偏左側,通過這些改進使灌注成功率顯著上升。陳浩宇等[3]設計出一種特殊針頭,可有效防止針頭滑脫,但大量實踐發現針頭滑脫多由于實際操作過程中碰到輸液管引起,正常灌注壓力下針頭并不會滑脫,實驗中我們通過捋順輸液管且盡量不觸碰它發現滑脫現象很少發生。在剪開右心耳時,開口要大一些,否則灌注液進的多出的少極易引起動物組織水腫,影響實驗結果的判斷。灌注時通常先快速用生理鹽水沖干凈血液避免紅細胞在后期的染色過程中造成非特異性染色,然后以先快后慢的方式用4%多聚甲醛灌注固定組織,這種方法可以提高組織固定效果[4]。此外,在灌注下一只動物時要及時排空灌注管中殘留的多聚甲醛,灌注管中也不應有氣泡,否則會造成空氣栓塞,以致影響局部組織的灌注效果。

3.2 準備工作

想要高效率地切出一張完整的切片,準備工作尤為重要。冰凍切片機應處于24 h恒溫待機狀態,切片前1 h,先將機器設定到切片所需的溫度,冷凍室溫度和樣品頭溫度可調整到-22 ℃左右,否則溫度過高切片容易皺折,過低則會出現組織碎裂。防卷板完整對于切出一張完整的切片至關重要,可以節省大量的時間。正常防卷板與切片刀角度為5°左右,防卷板的前緣與刀面有足夠的距離且略高于刀刃的最高點,以使切出的切片能順利通過刀與防卷板間的縫隙為宜[5]。

3.3 包埋

待組織在30%蔗糖溶液中沉底后,將其取出,并用濾紙吸去多余液體。利用高滲蔗糖溶液吸收組織中水分,減少組織含水量,降低冰凍切片時組織中冰晶的產生,防止組織出現冰晶空洞導致細胞形態發生改變。組織塊不宜過厚過大,一般應小于1 cm3,這樣有利于組織的速凍,組織過大切片時容易出現褶皺。本實驗將鋁箔紙制作成圓柱狀類似于包埋盒包埋組織,組織經過OCT包埋后立即置入-80 ℃低溫冰箱,使其迅速跨越冰晶形成的臨界溫度,顯著減少了冰晶的的產生且較好地保存組織的完整性,切片時組織周圍OCT膠形狀相對規則,切片不容易出現皺折[6]。此外,還要注意一定要確保樣品托底部干燥,否則在速凍時容易粘在冷凍臺上。

3.4 冷凍溫度

溫度的調節對于冰凍切片是非常重要的,應根據組織的種類和大小對溫度進行調節。對于樣品頭溫度,王秀萍[5]等認為:細胞致密且較硬的組織溫度控制在(-16)-(-20)℃;細胞疏松且較軟的組織溫度控制在(-20)-(-22)℃;脂肪組織溫度控制在(-22)-(-24)℃。我們對小鼠不同組織進行冰凍切片的實際操作中,切片機(Leica CM1950)的工作室溫度設置在(-20)-(-23)℃,腦組織等含水量較大的樣品頭溫度設置在(-18)-(-20)℃,肝、腎、脾等實質性器官組織溫度設置在(-19)-(-22)℃,心、肺等空腔器官為(-20)-(-23)℃。在這樣一個溫度范圍內切出來的切片比較完整,但是鑒于不同品牌的切片機的性能不盡相同,本文結果僅供同型號切片機參考。

3.5 切片

切片時搖動轉輪的速度要合適,過快或過慢都易造成切片皺折,正常8-10 r/min,先慢后快。組織切好后用常溫的載玻片貼片時要快、準、穩,順著一個方向稍微用力輕輕一帶即可將切片黏附在載玻片上。貼好的切片自然風干后要盡快收到切片盒中冷凍備用,避免空氣中灰塵及雜質污染切片,影響后期的染色質量。

總之,冰凍切片是較難掌握的實驗技術之一,以上這些細節和技巧對于切出高質量切片很重要,所以作為實驗技術人員需要具備高度的責任心和嚴謹的工作態度,嚴格按照規范操作并不斷總結和改進,才能熟練掌握冰凍切片技術,最終確保實驗結果的真實性和科學性。