化學(xué)計(jì)量學(xué)結(jié)合氣質(zhì)聯(lián)用法對(duì)4種食用動(dòng)物油判別模型的構(gòu)建

齊安安，周小平，*，雷春妮，馬 鑫，龐偉強(qiáng)

(1.西北師范大學(xué) 地理與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070;2.甘肅省出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫綜合技術(shù)中心，甘肅 蘭州 730010)

動(dòng)物油在食用油的應(yīng)用中具有不可替代性，食用油的質(zhì)量直接影響食用者健康。目前，植物油的摻假問(wèn)題嚴(yán)重影響食用油的質(zhì)量和安全[1]，而動(dòng)物油的安全性比植物油高，在人類正常食用油攝取量范圍內(nèi)選擇動(dòng)物性油脂更安全[2]。從食用油的風(fēng)味來(lái)看，動(dòng)物油的風(fēng)味是食用偏好的重要組成部分[3]。動(dòng)物性食用油不僅是人們生活的必需品，在增加食物的色、香、味方面起著重要的作用，同時(shí)也是人體不可缺少的營(yíng)養(yǎng)來(lái)源[4]。油脂的感官特性是衡量其品質(zhì)的重要方面，不同油脂具有各自獨(dú)特的風(fēng)味，受到各國(guó)學(xué)者的重視[5-6]。不同學(xué)者對(duì)單一品種食用油的研究主要集中于指紋圖譜的分析[7]，對(duì)多種類混合食用油的研究主要集中于脂肪酸特征識(shí)別方面[8-9]，而將揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)成分作為不同類型動(dòng)物油安全性判別指標(biāo)的研究較少。

化學(xué)計(jì)量學(xué)中的主成分分析法普遍應(yīng)用于揮發(fā)性成分含量與香氣描述等數(shù)據(jù)處理[10]，主成分分析作為一種產(chǎn)品品質(zhì)定量描述的分析方法[11]，在牛肉、羊肉等肉制品中已有所應(yīng)用；聚類分析以及判別分析也廣泛應(yīng)用于其他類香氣成分分析[12-14]，而以食用動(dòng)物油揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)為指標(biāo)對(duì)不同類型食用動(dòng)物油進(jìn)行判別和分類研究則鮮有報(bào)道。

本文應(yīng)用熱脫附/氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(TD/GC-MS)對(duì)4種動(dòng)物油(羊油、豬油、雞油、牛油)的風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行分析，通過(guò)NIST 14譜庫(kù)與Wiley譜庫(kù)初步定性，經(jīng)Massworks質(zhì)譜解析軟件確證后，利用峰面積歸一化法進(jìn)行定量分析，采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)4種動(dòng)物油進(jìn)行主成分分析、聚類分析以及判別分析，建立了動(dòng)物油的3個(gè)典則判別函數(shù)模型，實(shí)現(xiàn)了對(duì)雞油、牛油、羊油和豬油的較好識(shí)別。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

Agilent7890A-5975C氣質(zhì)聯(lián)用儀、HP-INNOWAX色譜柱(60 m×0.25 mm，0.5 μm，美國(guó)Aglient公司);SKC Pocket Pump210-1002采樣泵、溫控儀(成都科林分析技術(shù)有限公司)，Auto TD 熱脫附解吸儀、吸附管、吸附劑Tenax TA 60-80、玻璃棉(進(jìn)口)、20 mL頂空瓶、水分盒均購(gòu)于成都科林分析技術(shù)有限公司;烘箱以及KQ-600DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。全氟三丁胺標(biāo)準(zhǔn)溶液(Perfluorotributylamine)為Dr.Ehrenstorfer公司產(chǎn)品;羊油、牛油、雞油、豬油樣品購(gòu)于蘭州市城關(guān)區(qū)農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。

1.2 樣品前處理

取羊油、牛油與豬油樣品的固體油脂部分，裝入水分盒進(jìn)行密封除水融化;雞油在常溫下為液體狀，將其裝入水分盒進(jìn)行密封后，置于105 ℃烘箱中1 h進(jìn)行除水，取10 mL液體樣品移入20 mL頂空瓶中，并將頂空瓶封口。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1揮發(fā)性成分的收集將裝有樣品的20 mL頂空瓶置于80 ℃溫控儀中，連接裝有Tenax TA 60-80吸附劑的吸附管，吸附管一端接入頂空瓶(距離油面1 cm高度)，另一端連接SKC采樣泵，泵速150 L/min，采樣時(shí)間60 min，進(jìn)行揮發(fā)性風(fēng)味化合物富集。采集完成后將采樣管取下密封，待TD/GC-MS分析。測(cè)得的百分含量水平以平均值計(jì)算，有效數(shù)據(jù)量為128個(gè)。

1.3.2GC-MS條件熱脫附條件:一級(jí)解吸溫度:180 ℃;一級(jí)解吸時(shí)間:5 min;二級(jí)解吸溫度:280 ℃;二級(jí)解吸時(shí)間:8 min;進(jìn)樣時(shí)間:60 s;冷阱溫度:-30 ℃;傳輸線溫度:200 ℃;閥溫度:150 ℃;載氣:高純氦氣(純度≥99.999%);載氣壓力:90 kPa;驅(qū)動(dòng)氣體:空氣。

色譜條件:HP-INNOWAX(60 m×0.25 mm，0.5 μm)色譜柱;程序升溫:初始溫度60 ℃，保持1 min，以2 ℃/min升至210 ℃，保持1 min;載氣:高純氦氣(純度≥99.999%);進(jìn)樣口溫度:260 ℃;恒壓模式:10 psi;分流進(jìn)樣，分流比為5∶ 1。

質(zhì)譜條件:電子電離(Electron ionization，EI)源;電子能量:70 eV;接口溫度250 ℃;離子源溫度:230 ℃;溶劑延遲:5 min;采樣模式:分別采用全掃描和原始掃描兩種模式;質(zhì)量掃描范圍:m/z25～550 u。

1.3.3數(shù)據(jù)處理與質(zhì)譜檢索定性分析:通過(guò)NIST 14譜庫(kù)和Wiley 譜庫(kù)進(jìn)行揮發(fā)性有機(jī)化合物檢索，報(bào)告匹配度均大于800(最大值為1 000)的鑒定結(jié)果;以全氟三丁胺(PFTBA)標(biāo)準(zhǔn)液為外標(biāo)對(duì)樣品原始掃描質(zhì)譜圖進(jìn)行校正，利用Massworks質(zhì)譜解析軟件進(jìn)行揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的確證。

定量分析:采用安捷倫數(shù)據(jù)分析軟件對(duì)全掃模式的譜圖積分，通過(guò)面積歸一化法計(jì)算各種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)成分的相對(duì)含量，使得總含量為每種樣品中所有香氣物質(zhì)占總出峰面積的總百分?jǐn)?shù)。得出揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的相對(duì)含量后，利用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行主成分分析、聚類分析及判別分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 揮發(fā)性成分的定性分析

GC-MS聯(lián)用技術(shù)的最大優(yōu)勢(shì)是可利用MS數(shù)據(jù)對(duì)化合物進(jìn)行定性分析[15]。利用NIST 14譜庫(kù)與Wiley譜庫(kù)進(jìn)行初步定性，然后通過(guò)Massworks質(zhì)譜解析軟件的同位素峰形校正檢索技術(shù)(CLIPS)[16]和校正函數(shù)的參數(shù)優(yōu)化，獲取精準(zhǔn)分子量，通過(guò)校正后的質(zhì)譜圖進(jìn)行離子碎片解析，獲得4種動(dòng)物油的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的化學(xué)成分信息(見(jiàn)表1)。

GC-MS峰面積歸一化法是一種有效的定量方法[17]，在定性的基礎(chǔ)上應(yīng)用面積歸一化法進(jìn)行定量，通過(guò)安捷倫數(shù)據(jù)分析軟件的化學(xué)工作站積分法可測(cè)得4種食用動(dòng)物油揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的相對(duì)含量(見(jiàn)表1)。

表1 4種動(dòng)物油的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的化學(xué)成分信息Table 1 Chemical composition information of volatile flavor substances in four animal oils

(續(xù)表1)

Animal oil varietiesGoat oil Tallow oil Lard oil Chicken oil(羊油) (牛油) (豬油) (雞油)PeaknumberRetentiontime/minMolecularformulaCompound Spectralaccuracy(譜圖精度, %)Monoisotope(精準(zhǔn)分子量)Match/R.match(正/反匹配度)Match/R.match(正/反匹配度)Match/R.match(正/反匹配度)Match/R.match(正/反匹配度)Category(類別)3532.594C6H14O正己醇*102.103 9912/915884/900915/917863/868醇3635.091C10H222,7-二甲基辛烷*142.172 2***823/830烴3736.055C9H18O壬醛*142.135 2941/944948/950946/947916/922醛3837.337C21H442,6,10,14-四乙基十六烷*274.171 6901/905***烴3938.439C8H12O5-乙基己烯-1-甲醛98.698 9124.088 3827/833**822/854醛4038.912C8H14O反-2-辛烯醛***902/903**醛4139.055C8H16O1-辛烯-3-醇*128.119 6910/914908/909845/848885/890醇4239.558C7H16O正庚醇*116.119 6820/871910/921834/855800/810醇4340.032C6H4Cl21,4-二氯苯99.258 2145.968 5865/932940/946943/949917/924烴4441.295C7H10O(E,E)-2,4-庚二烯醛99.266 2110.072 6840/856***醛4542.355C6H10S2二烯丙基二硫99.605 3146.021 8842/855***其他4641.822C8H18O2-乙基己醇*130.135 8*859/895861/918826/844醇4743.487C7H10O3-乙基-1,4-己二烯99.071 8110.072 6909/915**813/841烴4844.248C15H26(2Z,4E)-3,7,11-三甲基10,2,4-十二碳三烯*206.202 9802/806***烴4945.870C7H6O苯甲醛99.598 7106.041 3922/926901/916918/944801/824醛5046.032C9H16O反式-2-壬醛*140.119 6875/875***醛5146.422C8H18O正辛醇*130.135 8*917/916907/908867/868醇5253.159C4H6O2γ-丁內(nèi)酯*86.036 2881/952***酯5353.674C8H8O苯乙醛99.350 6120.057 0819/801***醛

由表1可得，通過(guò)譜庫(kù)檢索獲得的匹配度均在800以上，Massworks質(zhì)譜解析軟件可確證光譜精度均在90%以上的4種動(dòng)物油的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，在相同的樣品前處理以及分析條件下共確證53種不同的揮發(fā)性化合物，其中羊油的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)有43種，牛油、豬油的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)各為22種，雞油的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)有31種。從4種動(dòng)物油的總體揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)來(lái)看，醇類占13.21%，醛類占28.30%，烴類占39.62%，酮類占7.54%，烯、酯、醚及其他類各占3.77%。研究結(jié)果表明，烴類、醛類占主體地位，含有6～10個(gè)碳原子的飽和及不飽和醛是最主要的揮發(fā)性成分，其閾值較低，烷烴類化合物的閾值較高，對(duì)香氣成分的貢獻(xiàn)值小[18];醛類化合物對(duì)香氣成分有貢獻(xiàn)，同時(shí)也能夠反應(yīng)生成生香前體物質(zhì)[19]。

圖1 三維載荷圖Fig.1 Three-dimensional load diagram

2.2 揮發(fā)性組分的提取分析

篩選4種食用動(dòng)物油(羊油、牛油、雞油、豬油)中相對(duì)含量較高的揮發(fā)性成分，應(yīng)用揮發(fā)性成分指標(biāo)的因子分析法，獲取揮發(fā)性成分中貢獻(xiàn)值較大的成分，為主成分分析步驟提供最大信息量。結(jié)果表明，除烴類化合物外，2，3-丁二酮、戊醛、三氯乙烯、正己醛、庚醛、2-正戊基呋喃、(1S，3R)-順式-4-蒈烯、烯丙基甲基二硫醚、正辛醛、2-庚烯醛、正己醇、壬醛、5-乙基己烯-1-甲醛、1-辛烯-3-醇、正庚醇、2-乙基己醇、3-乙基-1，4-己二烯、苯甲醛、正辛醇、γ-丁內(nèi)酯在4種油脂中相對(duì)含量較高;通過(guò)因子分析的信息篩選信息貢獻(xiàn)值最高的19個(gè)揮發(fā)性化合物指標(biāo)作為主成分分析以及判別分析的變量因子。

2.3 主成分分析

利用SPSS 22.0進(jìn)行主成分分析，由KMO值>0.6，可得出本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)適合做因子分析，在Bartlett’s檢驗(yàn)中統(tǒng)計(jì)值的顯著性概率P<0.05，同時(shí)可得出第一、第二和第三主成分的特征值分別7.502、6.700和3.909，其累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為95.319%。因此提取前3個(gè)主成分時(shí)，羊油、牛油、雞油、豬油的分析效果良好(圖1)。

從總方差解釋(表2)可以看出，前3個(gè)公共因子的累計(jì)方差達(dá)95.319%，而其余16個(gè)公共因子的特征值較小，對(duì)解釋原有變量的貢獻(xiàn)值較小，因此提取前3個(gè)公共因子符合統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的要求。

2.4 聚類分析

由揮發(fā)性成分指標(biāo)所獲得的主成分分析數(shù)據(jù)可得主成分1、主成分2、主成分3(FAC1、FAC2、FAC3)變量值，以平方歐式距離為度量準(zhǔn)則，組間連接法為組群合并準(zhǔn)則，用SPSS 22.0進(jìn)行K均值聚類分析，聚類數(shù)為4，最大迭代數(shù)為10，最終在SPSS 22.0中聚類成功，獲得最終聚類中心(表3)。從最終聚類中心之間的距離可看出4個(gè)聚類中心無(wú)重合點(diǎn)。

表2 總方差解釋Table 2 Total variance explained

extraction method：principal component analysis

表3 最終聚類中心Table 3 Final cluster centers

表4 主成分特征值Table 4 Eigenvalues of main components

*first 3 canonical discriminant functions were used in the analysis

圖2 判別式函數(shù)散點(diǎn)圖Fig.2 Discriminant function scatter plot

2.5 判別分析

應(yīng)用SPSS22.0軟件通過(guò)主成分分析得到的3個(gè)主成分FAC1、FAC2和FAC3作為判別分析的自變量;K均值聚類中得到的聚類號(hào)作為判別分析分組變量;然后進(jìn)行判別模型的擬合;數(shù)據(jù)輸出得到規(guī)范判別函數(shù)特征值，結(jié)果如表4所示。其中累計(jì)方差貢獻(xiàn)率100%(F1:68.9%，F(xiàn)2:21.7%，F(xiàn)3:9.4%)，表明3個(gè)主成分所得到的模型數(shù)據(jù)能夠?qū)?種動(dòng)物油進(jìn)行判別;其中差異變量和標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范判別式函數(shù)之間共享的組內(nèi)相關(guān)性均達(dá)97.5%以上;依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范判別式函數(shù)系數(shù)，獲得判別函數(shù)訓(xùn)練模型，得到的3個(gè)典則判別式函數(shù)如下:

Y1=1.073FAC1+0.314FAC2+0.007FAC3，r2=0.999

Y2=-0.764FAC1+0.796FAC2+0.549FAC3，r2=0.997

Y3=0.687FAC1-0.775FAC2+0.623FAC3，r2=0.992

將雞油、豬油、牛油、羊油的主成分(FAC1、FAC2和FAC3)數(shù)據(jù)帶入上述方程，可得出4種動(dòng)物油揮發(fā)性風(fēng)味成分所對(duì)應(yīng)典則函數(shù)的判別值，即距離類別的重心值，由特征值即前兩個(gè)典則判別函數(shù)的累計(jì)貢獻(xiàn)值90.600%，得出以典則函數(shù)式Y(jié)1、函數(shù)式Y(jié)2作為橫、縱坐標(biāo)軸的判別式函數(shù)散點(diǎn)圖(圖2)。圖2表明，4種食用動(dòng)物油的分組良好;對(duì)4種食用動(dòng)物油樣(雞油4個(gè)，豬油5個(gè)，羊油8個(gè)，牛油6個(gè))進(jìn)行驗(yàn)證判別，由典則判別函數(shù)模型數(shù)據(jù)驗(yàn)證結(jié)果可將4種食用動(dòng)物油區(qū)分開(kāi)，分別對(duì)應(yīng)1、2、3、4組類，且對(duì)應(yīng)的驗(yàn)證準(zhǔn)確度為100%(見(jiàn)表5)，說(shuō)明判別分類的效果良好。

表5 判別結(jié)果Table 5 Classification resultsa

a.100% of original grouped cases correctly classified

3 結(jié) 論

本文采用GC-MS聯(lián)用法對(duì)4種食用動(dòng)物油的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行分析，經(jīng)譜庫(kù)數(shù)據(jù)檢索與Massworks質(zhì)譜解析軟件確證，共鑒定出53種成分，包括醇類、醛類、烴類、酮類、烯、酯、醚類等;從總體揮發(fā)性成分類別來(lái)看，羊油的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)數(shù)量最大，而豬油與牛油的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)數(shù)量相同，但揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)類別與含量差異較大;應(yīng)用SPSS 22.0數(shù)據(jù)分析軟件對(duì)4種動(dòng)物油進(jìn)行主成分分析、聚類分析、判別分析，不同食用動(dòng)物油的分類與判別效果良好。本研究結(jié)果可為食用動(dòng)物油類型判別與清真食品動(dòng)物源性成分鑒定提供參考。