云南省南部地區(qū)蚊攜帶乙型腦炎病毒的檢測和遺傳進化分析

肖朋朋 ，李成輝 ，張金勇 ，韓繼成 ，郭曉芳，周紅寧 ，魯會軍 ，金寧一

（1. 延邊大學醫(yī)學院，吉林延吉 133002；2.軍事科學院軍事醫(yī)學研究院軍事獸醫(yī)研究所，吉林長春 130122；3. 云南省寄生蟲病防治所，云南普洱 665000）

乙型腦炎（Japanese encephalitis，JE）由乙型腦炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）感染引起，在亞洲和太平洋地區(qū)廣泛流行[1-3]，每年約有3.5萬～5萬人感染，1萬～1.5 萬人死亡[1-3]，且50%的患者出現(xiàn)后遺癥[4-6]。全球近300萬人暴露在JE流行地區(qū)[2-3]。由于流行地區(qū)旅游業(yè)的發(fā)展，JE發(fā)病率不斷增加[7]。云南省南部地區(qū)被北回歸線貫穿，地形地貌獨特，具有熱帶、亞熱帶氣候特點，終年平均溫度在20 ℃左右，平均降水量約8 mm/d，利于蚊類滋生和繁殖，全年均有蚊類分布[8-9]。JEV是云南省分布最廣、危害較大的一種蟲媒病毒，主要流行基因I型和III型。在云南省，基因I型最早分離于1977年，1978—2004年的分離株幾乎均為基因III型（1982年分離到基因I型），近十年基因I型成為主要流行型[10]。三帶喙庫蚊為JEV主要傳播媒介[11-12]，豬是JEV重要動物宿主[13]，從而形成了“豬-蚊蟲-人”的循環(huán)鏈[14]。對蚊攜帶JEV的檢測和調查，有益于進一步掌握病毒流行情況，及時預警JE流行。

本研究對云南省南部地區(qū)蚊攜帶JEV進行了調查檢測，對擴增的JEV基因進行了遺傳進化分析，以便為該地區(qū)的JE防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

DNA聚合酶、dNTP、ddH2O：從TaKaRa公司購置；引物：吉林省庫美生物科技有限公司合成；RNA提取試劑盒：采購于杭州博日科技有限公司；反轉錄試劑M_MLV反轉錄酶、RNA酶抑制劑RNasin?：購置于Promega公司。

1.2 蚊樣品采集

2016年8—10月，從南部西盟縣（N22o 65'，E99o59'）、 寧 洱 縣（N23o06'，E101o04'）、 思 茅區(qū)（N22o79'，E100o98'）、 景 洪 市（N22o00'，E100o77'），采集三帶喙庫蚊、中華按蚊、騷擾阿蚊、白紋伊蚊、達勒姆阿蚊及淡黃藍帶蚊共計6 952只，凍存于液氮中待用。采樣地點分布見圖1。

1.3 病毒檢測

將6 952只蚊根據(jù)采集地和蚊種合并為69份樣品（表1）。將樣品置于無菌EP管中，加入1 mL樣品研磨液SM buffer，用組織研磨儀，60 Hz 3 min 研磨蚊樣品，12 000×g 離心 20 min，取上清；按照病毒RNA提取試劑盒（產(chǎn)品貨號BSC62M1）說明書提取病毒RNA，進行JEV RTPCR檢測；將DNA目的片段回收測序，對測序正確的樣品進行JEV E基因序列擴增并測序。JEV E基因巢式PCR檢測及擴增引物見表2。

圖1 云南地區(qū)蚊樣品采樣地點分布

表1 蚊種采集數(shù)量及分組

1.4 E基因變異分析

從陽性蚊樣品中擴增JEV E基因序列，用MEGA 7.0軟件對擴增的序列進行比對分析。

2 結果

2.1 蚊樣品JEV檢測

來自4個采樣點的69份蚊樣品中，通過RT-PCR檢測，檢出7份JEV陽性樣品，平均陽性率為10.14%。其中，思茅區(qū)和寧洱縣蚊樣品JEV陽性率最高，均為25.00%，景洪市次之，為6.67%，西盟縣最低，為5.26%（表3）。PCR檢測陽性結果圖譜見圖2。

2.2 JEV E基因變異分析

表2 JEV檢測和E基因擴增引物

表3 蚊樣品JEV檢測

圖2 PCR檢測陽性結果圖譜

從7份JEV陽性蚊樣品中擴增E基因序列，分別從西盟縣50%（1/2）、寧洱縣100%（2/2）以及思茅區(qū)100%（2/2）陽性蚊樣品中擴增到5條完整的E基因序列（YN2016-1/2/3/4/5）。將這5條E基因序列與22條國內外JEV代表株進行比對分析，發(fā)現(xiàn)同源性為98.6%～99.8%，而且均與2009年分離的JEV老撾株同源性最高，為97.3%～98.8%。通過核苷酸變異分析發(fā)現(xiàn)，在E基因第1323位核苷酸位點，5條E基因序列首次出現(xiàn)了C堿基替換（圖3）；氨基酸變異分析發(fā)現(xiàn)，YN2016-1在E蛋白第340位氨基酸位點首次出現(xiàn)了丙氨酸替換（圖4）。

2.3 JEV E基因系統(tǒng)進化分析

將擴增的5條完整JEV E基因序列（GenBank序列號MG644382-MG644386）與22條國內外JEV代表株做進化樹分析，發(fā)現(xiàn)5條E基因序列均屬于基因I型，且與2009年分離的JEV老撾株親緣關系最近。

圖3 蚊樣品JEV E基因核苷酸變異

圖4 蚊樣品JEV E蛋白氨基酸變異

3 討論

JE是全球最重要的病毒性腦炎[15-17]，因蚊叮咬而傳播，可造成大范圍流行[18-21]。蚊吸血感染JEV后，病毒在蚊體內復制，并通過叮咬感染動物和人，完成JEV的循環(huán)鏈傳[22-24]。在過去的50年中，JEV流行地域有擴大趨勢[25-26]。1935年我國首次報道夏季腦炎疫情[27]；1940年，JE首次在俄羅斯東部各州被發(fā)現(xiàn)[28]；1965年越南北部JE疫情[29]和1969年泰國北部清邁病例相繼被報道[30]；1985年斯里蘭卡首次發(fā)生JE流行，造成410人發(fā)病，75人死亡[31]。目前，JE流行于24個國家和地區(qū)，均為亞洲和西太平洋地區(qū)國家。全球每年約67 900人發(fā)病（平均發(fā)病率1.8/100 000），其中近75%的患者（51 000）為0～14歲的兒童（平均發(fā)病率5.4/100 000），我國患者約占50%（33 900）[32]。云南省南部地區(qū)位于我國西南邊境地帶，緯度較低，氣候溫暖濕潤，蚊類可越冬生存，利于JEV傳播[33-35]。豬是JEV重要擴散宿主，為蚊傳播JEV提供了便利[36-37]。2012年，梁國棟[32]對我國JEV流行做了詳細整理和分析，為今后JEV研究提供了幫助。本研究針對云南省南部地區(qū)蚊進行JEV檢測，了解了該地區(qū)JEV流行情況，為進一步的JE防控提供了參考。

圖5 蚊樣品JEV E基因系統(tǒng)進化

本研究檢測發(fā)現(xiàn)，云南省南部地區(qū)蚊JEV攜帶率為10.14%（7/69），與宋帕[38]的調查結果相似（老撾南塔省芒新縣三帶喙庫蚊傳黃病毒陽性率為15.56%），而低于龔道方等[39]對云南省新平縣蚊JEV的調查結果（陽性率為8.33%）。從思茅區(qū)、寧洱縣和西盟縣蚊樣品中擴增的5條完整JEV E基因序列均屬于基因I型，且與2009年老撾的JEV分離株親緣關系最近。徐可樹等[40]研究顯示，JEV E基因變異可導致病毒增殖性降低。分析顯示，YN2016-1在E蛋白第340位氨基酸位點首次出現(xiàn)丙氨酸替換。E基因為JEV毒力基因，該位置變異可影響病毒表面免疫球蛋白樣結構的折疊，進而影響病毒免疫原性[41]。

4 結論

本研究表明：JEV在云南省南部地區(qū)蚊樣品中存在較高的帶毒率，尤其是思茅區(qū)和寧洱縣，JEV陽性率均高達25.00%，說明這兩個地區(qū)存在較高的JEV傳播風險；JEV毒力基因的變異對該地區(qū)的JE防控可能帶來新的挑戰(zhàn)，應注意加強監(jiān)測。