副豬嗜血桿菌脂多糖的提取、鑒定及初步應(yīng)用

楊 杰，李建達，叢曉燕，楊勝男，任素芳，郭立輝，陳 智，陳 蕾，曾 昊，孫文博，時建立，李 俊，邱文彬，3，吳家強，3，于 江

（1. 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，山東省畜禽疫病防治與繁育重點實驗室，山東濟南 250100；2. 青島市動物疫病預(yù)防控制中心，山東青島 266000；3. 山東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東濟南 250014）

副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis，HPS）是定居于健康豬上呼吸道的常在菌，在特定條件下可以侵入機體，引起多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎、腦膜炎等疾病[1]。近年來，隨著我國養(yǎng)豬業(yè)規(guī)?；图s化發(fā)展，副豬嗜血桿菌病常以繼發(fā)方式存在于規(guī)?；i場，且暴發(fā)規(guī)模呈逐漸上升趨勢，導(dǎo)致斷奶到保育階段仔豬的發(fā)病率及死亡率增加，對養(yǎng)豬業(yè)造成較大經(jīng)濟損失，影響了養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展，已成為我國豬場中重要的細菌性傳染病[2]。

HPS血清型復(fù)雜，可分為15個血清型，另外還有20%左右的分離菌株不能進行血清學(xué)分型[3]。蔡旭旺等[4]研究表明，我國以血清4型和5型最為流行，其次是13型、14型和12型。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，血清1型在我國也較為流行[5]。近幾年，越來越多研究者致力于HPS毒力因子和致病機制研究。目前報道的HPS毒力因子主要包括脂多糖（LPS）、轉(zhuǎn)鐵蛋白、菌毛、莢膜（CP）、外膜蛋白（Outer membrane proteins）等[6-12]，但對LPS的研究較少。Wang等[13]通過用HPS血清5型菌株接種動物，發(fā)現(xiàn)血液中LPS抗體的出現(xiàn)與血栓形成以及彌漫性血管內(nèi)凝血密切相關(guān)，說明HPS中的LPS 具有與其他革蘭氏陰性細菌內(nèi)毒素相似的活性。本研究通過提取、鑒定，獲得高純度的LPS，并將其應(yīng)用于豬肺泡巨噬細胞，為進一步闡明LPS的致病機制奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 HPS血清5型LZ株：由本實驗室分離、鑒定、保存。

1.1.2 主要試劑與儀器 Tris平衡酚：購自北京索萊寶科技有限公司；DL2000 DNA Marker：購自大連寶生物公司；RNase A：購自Sigma公司；聚乙二醇4000：購自上海玉博生物科技有限公司；透析袋、DNase I：購自Solarbio公司；BCA蛋白定量試劑盒：購自北京康為世紀生物科技有限公司；蛋白酶K：購自上海玉博生物科技有限公司；凝膠成像系統(tǒng)：購自Bio-Rad公司；真空冷凍干燥機Alpha 1-2 LD plus：購自天津鈞星瑞科技有限公司；超速冷凍離心機：購自貝克曼庫爾特有限公司；酶標儀：購自美國伯騰儀器有限公司；NanoDrop 2000微量紫外可見分光光度計：購自賽默飛世爾科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基制備 TSA培養(yǎng)基：稱取40 g TSA粉末（美國BD公司），加入到940 mL蒸餾水中，滅菌后冷卻至50 ℃左右，再加入50 mL新生牛血清（濟南勁牛公司）和10 mL過濾除菌的0.1%的NAD（Sigma公司）溶液，充分搖勻后倒平皿。TSB培養(yǎng)基：稱取30 g TSB粉末（美國BD公司）加入到940 mL蒸餾水中，高壓滅菌；臨用前加入50 mL新生牛血清（濟南勁牛公司）和10 mL過濾除菌的0.1%的NAD（Sigma公司）溶液，混合均勻。

1.2.2 菌體制備及收集 將凍存的HPS血清5型LZ株菌種復(fù)蘇后，挑取單菌落接種于10 mL TSB培養(yǎng)基，37 ℃搖床培養(yǎng)16 h；按1%的比例接入種子液，于37 ℃ 180 r/min搖床培養(yǎng)至OD600nm=1.3；菌液經(jīng)5 000 r/min離心5 min，收集菌體；用磷酸緩沖液（PBS）洗滌2次，5 000 r/min離心15 min，將沉淀稱濕重，用3倍體積無菌去離子水懸浮。

1.2.3 LPS提取與純化 參考熱酚水法[14]提取LPS，并作適當改進。將菌懸液反復(fù)凍融3次后，加入等體積的68 ℃ 90%的苯酚溶液，68 ℃水浴，邊加邊振蕩；水浴1 h后，冰上冷卻至10 ℃，8 000 r/min離心30 min，收集上層水相；將下層酚相補充等體積去離子水，按上述方法重復(fù)抽提1次；合并兩次水相，加入等量的90%苯酚溶液重復(fù)抽提1次；合并所有水相，裝于透析袋中，流水透析1 d，蒸餾水4 ℃透析2 d（每天換水5次），到FeCl3檢測無紫色出現(xiàn)為止；按每100 mL溶液加入聚乙二醇6000固體4 g的比例，將溶液濃縮為原來的1/4；濃縮后加入終濃度為50 μg/mL的DNase I和50 μg/mL的RNase A，37 ℃酶解過夜，再加入終濃度為100 μg/mL的蛋白酶K，65 ℃作用1 h；將處理后的樣品置于100 ℃沸水中加熱10 min，冷卻至室溫后，4 ℃ 12 000 r/min離心30 min；收集上清，加入2倍體積丙酮，4 ℃靜置過夜，4 ℃ 3 500 r/min離心15 min，沉淀稱重；用無菌超純水配成濃度為15～20 mg/mL溶液后超離，4 ℃30 000 r/min離心2 h，下層膠體即為LPS；冷凍干燥即得純化的 LPS 提取物，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 脂多糖定性試驗 取LPS溶液100 μL，加入現(xiàn)配置的斐林試劑（0.1 g/mL NaOH與0.05 g/mL CuSO4按1:1混合）100 μL，同時做葡萄糖陽性對照和單蒸水陰性對照，沸水浴反應(yīng)2 min，觀察溶液顏色變化。

1.2.5 LPS成分測定

1.2.5.1 多糖含量測定 采用硫酸-苯酚法測定LPS糖含量。配置0.1 mg/mL葡萄糖溶液，分別吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL裝入試管，用無菌去離子水補至1.0 mL，每管加入1 mL 6%苯酚溶液并搖勻，再迅速加入5 mL濃硫酸，搖勻，靜置10 min，置65 ℃水浴中18 min，取出后迅速冰浴冷卻至室溫，用酶標儀檢測490 nm處吸光值，繪制標準曲線。另取100 μL樣品加入900 μL去離子水，按上述方法，檢測OD490nm值，利用標準曲線方程計算樣品多糖含量。

1.2.5.2 蛋白含量測定 采用BCA法測定蛋白含量，按說明書繪制標準曲線。取100 μL提取物加入900 μL去離子水，按說明書方法重復(fù)檢測3次，取平均值，根據(jù)標準曲線方程計算提取物中的蛋白含量。

1.2.5.3 核酸含量測定 用NanoDrop 2000微量紫外可見分光光度計測定提取物中核酸含量。

1.2.5.4 瓊脂凝膠電泳 1.5%的瓊脂凝膠電泳分析。2 μL LPS 加入 1 μL 6×Loading Buffer，80 V 恒壓電泳20 min后，用GelDox XR+凝膠成像系統(tǒng)觀察。

1.2.5.5 SDS-PAGE電泳及銀染 參考文獻[13，15]方法，對提取物進行SDS-PAGE電泳，結(jié)束后銀染，拍照分析結(jié)果。

1.2.6 LPS在豬肺泡巨噬細胞中的應(yīng)用 將106CFU/mL的原代肺泡巨噬細胞接入24孔板，37 ℃5% CO2培養(yǎng)過夜，然后分別加入107CFU的HPS和10 μg的LPS提取物，同時設(shè)TLR4抑制劑（100 ng/mL TAK-242處理1 h）和空細胞對照；培養(yǎng)12 h后，棄營養(yǎng)液，用滅菌PBS沖洗2次后，用1 mL Trizol裂解細胞，提取細胞總mRNA；用熒光定量PCR檢測IL-1β表達量，試驗重復(fù)3次。IL-1β引物序列見表1。

表1 IL-1β引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 LPS提取與純化

HPS在1 000 mL TSB培養(yǎng)基中培養(yǎng)1 d后，收集的菌體濕重為2.50 g，純化的LPS為64 mg，平均LPS產(chǎn)率為2.56%。

2.2 多糖定性試驗

提取物與斐林試劑反應(yīng)無顏色變化，而以葡萄糖作陽性對照的溶液變?yōu)榇u紅色，表明提取物中不含還原性單糖（圖1）。

圖1 多糖與斐林試劑反應(yīng)的還原性分析

2.3 LPS多糖含量

以0.1 mg/mL葡萄糖為標準品制作標準曲線，其方程為y=0.528 1x+0.059 4，R2=0.996 6。將所測樣品的OD490nm平均值代入方程，得出多糖濃度為209.4 μg/mL，純化的LPS多糖含量為3.27%（圖2）。

圖2 葡萄糖標準曲線

2.4 LPS蛋白含量

以BCA溶液制作標準曲線，其方程為：y=1.042 4x+0.172 7，R2=0.991 4。從標準曲線中得出提取物中蛋白濃度為0.49 mg/mL，通過計算得出純化的LPS中蛋白含量為0.77%（圖3）。

2.5 LPS核酸含量

用NanoDrop 2000測得核酸總量為575.1 μg/mL，通過計算得出核酸含量為0.90%。

2.6 瓊脂糖凝膠電泳

純化后的提取物中含有少量核酸雜質(zhì)，核酸片段大小低于100 bp（圖4）。

2.7 SDS-PAGE電泳及銀染

SDS-PAGE電泳和銀染鑒定結(jié)果顯示，提取、純化的LPS呈典型的多糖特異性梯狀條帶（圖5）。

2.8 LPS在豬肺泡巨噬細胞中的應(yīng)用

分別用HPS和LPS提取物作用于豬肺泡巨噬細胞，發(fā)現(xiàn)兩者分別作用后，豬肺泡巨噬細胞IL-1β的表達量均顯著上調(diào)（P＜0.05），且HPS全菌感染細胞的IL-1β上調(diào)更顯著。TLR4抑制劑TAK-242作用組較未作用組，IL-1β表達量顯著降低（P＜0.05），說明HPS及其LPS均能引起宿主細胞IL-1β表達量的上調(diào)，但抑制TLR4受體會降低LPS誘導(dǎo)的IL-1β的表達（圖6）。

3 討論與結(jié)論

圖3 BCA標準曲線

圖4 LPS提取物瓊脂糖凝膠電泳

圖5 銀染鑒定結(jié)果

圖6 豬肺泡巨噬細胞IL-1β相對表達量

HPS是豬上呼吸道的一種常在菌，可影響2周齡到4月齡的豬只，主要在斷奶后的保育階段引起發(fā)病，發(fā)病率一般為10%～15%，嚴重時死亡率可達50%，是影響全球養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展的重要細菌之一[16]。近幾年，副豬嗜血桿菌病常與豬繁殖與呼吸綜合征、豬圓環(huán)病毒病以混合或繼發(fā)形式出現(xiàn)，導(dǎo)致發(fā)病豬死亡率逐漸增高。因此，關(guān)于HPS毒力因子及致病機制的研究越來越廣泛。本試驗主要致力于HPS毒力因子LPS的提取及純化鑒定，并應(yīng)用于豬肺泡巨噬細胞，檢測IL-1β表達量變化情況，為HPS對宿主細胞的致病性研究提供理論依據(jù)。

脂多糖LPS為革蘭陰性菌細胞壁的主要成分，在結(jié)構(gòu)上可分為O-側(cè)鏈多糖、核心多糖及脂類A，是主要致病因素之一。大劑量LPS可引起內(nèi)皮細胞的損傷和屏障功能的改變，導(dǎo)致發(fā)生呼吸道疾病以及發(fā)熱、低血壓、膿毒性休克，甚至死亡。而微量LPS能活化單核巨噬細胞系統(tǒng)，促進細胞因子釋放以及補體的活化和抗體的產(chǎn)生，對特異性免疫反應(yīng)具有調(diào)節(jié)作用，如抗腫瘤、增強機體特異性抵抗力等[17-18]。目前，國內(nèi)外報道的提取脂多糖方法主要有3種：三氯乙酸法、酚水法和酚-氯仿-石油醚法。不同的提取純化方法對LPS的產(chǎn)率、純度和生物活性有很大影響。酚水法提取的LPS濃度和免疫活性強于其他兩種方法，且因LPS產(chǎn)量高、操作簡單而被廣泛用于LPS提取。盡管目前已有商品化的細菌LPS提取試劑盒，且已有研究使用過該方法[19-20]，但試劑盒僅適合少量LPS提取。任慧君等[21]通過熱酚水法提取HPS的LPS，將粗提的LPS經(jīng)過葡聚糖凝膠層析柱，獲得純化的LPS。該方法對儀器要求較高。本試驗采用酚水法，通過聚乙二醇6000濃縮粗提LPS，再經(jīng)過DNase I、RNase A和蛋白酶K處理，去除DNA、RNA和蛋白質(zhì)，最終用丙酮沉淀，超離獲得純化的LPS，平均LPS產(chǎn)率為2.56%。該結(jié)果雖然低于馮將等[22]豬源大腸桿菌的產(chǎn)率（3.74%），但高于楊成蘭等[14]丙型副傷寒沙門氏菌的產(chǎn)率（1.48%）和劉紅亮等[23]腸出血性大腸桿菌的產(chǎn)率（1.025%）。該方法雖然較上述方法復(fù)雜，但對儀器沒有特殊要求，操作方便易行。

本試驗提取的LPS雖然含有少量蛋白，但在LPS提取純化過程中經(jīng)過苯酚和蛋白酶K處理，會使蛋白變性、結(jié)構(gòu)破壞，從而失去了蛋白原有的功能。酶解法純化后的LPS提取物中雖然含有少量核酸，但用商品化的大腸桿菌LPS作比對，也能檢測出。

綜上，本試驗提取的HPS LPS純度較高，蛋白和核酸含量較少，能夠引起宿主細胞細胞因子變化，可用于HPS LPS致病機制的進一步研究。