肝硬化患者血型和病情分級與VWF、FVIII和 ADAMTS13 因子的關系

潘優敏 郭仁勇 陳瑜

310003 杭州，浙江大學醫學院附屬第一醫院輸血科（潘優敏），檢驗科（郭仁勇、陳瑜）

肝硬化患者血液系統中促凝和抗凝因子的失衡引起局部或全身系統的微循環障礙[1-2]。凝血系統成分的變化影響肝硬化患者肝臟損傷的嚴重程度，從而導致了并發癥的發生，如門靜脈血栓或腹水等[3]。血管性血友病因子（VWF）是內皮細胞和巨核細胞合成的多聚體糖蛋白，可介導血小板黏附于皮下膠原蛋白直接導致靜脈血栓的形成。VWF是血漿VⅢ因子（F VⅢ）的載體，間接保護FVⅢ不受蛋白水解酶的降解。血管性血友病因子裂解蛋白酶（ADAMTS13）主要表達于肝臟的星狀細胞，是降解VWF結構的一種金屬蛋白酶[4]。

ABO血型系統已被認為是VWF的主要決定性因素之一，VWF蛋白中存在類似于A和B血型抗原的低聚糖[5]。A和B等位基因編碼的糖基轉移酶可通過H抗原抑制ADAMTS 13酶對血漿VWF的水解作用。O血型人群缺乏糖基轉移酶，其血漿VWF水解率明顯高于非O血型人群，導致其血漿中VWF水平明顯降低。本研究通過檢測不同血型肝硬化患者中VWF抗原（VWF:Ag）、F VⅢ活性（F VⅢ:Ac）及 ADAMTS13抗原（ADAMTS13:Ag）的水平，探討肝硬化患者血型和病情分級與3種因子的關系。

1 對象和方法

1.1 對象 收集2016年5月至2017年4月在浙江大學醫學院附屬第一醫院治療的228例肝硬化患者（肝硬化患者組），其中男 152例，女 76例，年齡 30～60（54.9±5.5歲）。肝硬化診斷標準根據全國性病毒性肝炎的預防和診療計劃[6]。入選標準：入院前3個月內未作任何肝臟疾病治療。根據本研究設計要求，排除標準：存在高血壓、肝細胞癌、糖尿病、凝血障礙、敗血癥、心血管疾病、抗凝或皮質類固醇使用、腎移植、艾滋病毒感染和懷孕的肝硬化患者。健康對照組為同期本院正常體檢人群168 例，其中男 106 例，女 62 例，年齡 30～60（54.0±9.5歲）。兩組對象性別、年齡比較，差異均無統計學意義（均P＞0.05）。本研究符合人體試驗倫理學的標準并得到本院倫理委員會批準，患者均簽署知情同意書。

1.2 標本收集與檢測 入院后第1天清晨采集患者靜脈血樣送檢。使用含檸檬酸三鈉的試管在1 500r/min、4℃條件下離心10min分離出血漿，采用酶聯免疫吸附試驗（試劑盒由美國R&D公司提供）檢測VWF:Ag和ADAMTS13:Ag，使用德國Siemens公司試劑盒在Sysmex CA7000全自動凝血分析儀上（日本Sysmex公司）檢測F VⅢ:Ac、纖維蛋白原（Fib）及D-二聚體的水平；含有乙二胺四乙酸（2.4mg/2ml靜脈血樣）的試管收集的血樣標本采用抗A抗B血型定型試劑（中國上海血液生物醫藥有限公司）以間接方法檢測ABO血型的表現型，使用pocH-80i血液分析儀（日本Sysmex公司）檢測PLT；無任何抗凝劑試管的血樣標本在3 000r/min、4℃條件下離心10min立即分離出血清，使用德國Roche公司專用試劑在日立7600自動生化分析儀（日本Hitachi公司）檢測ALT、AST和TB水平。健康對照組人群均在清晨采集靜脈血標本后按上述方法收集及檢測。

1.3 觀察項目 比較兩組研究對象的性別、年齡和上述檢測項目所得結果等臨床參數；O血型與非O血型亞組進行比較；根據Child-Turcotte-Pugh（CTP）和終末期肝病模型（MELD）的等級評分，對不同疾病程度肝硬化患者O血型與非O血型亞組間VWF:Ag、F VIII:Ac、ADAMTS13:Ag水平進行比較。

1.4 統計學處理 采用SPSS 16.0統計軟件，正態分布的計量資料采用表示，兩組樣本臨床參數計量資料的比較采用獨立樣本t檢驗，多組間的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，計數資料比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組研究對象的臨床參數比較 見表1。

表1 兩組研究對象的臨床基本信息和分布特征比較

由表1可見，與健康對照組比較，肝硬化患者組血漿VWF:Ag和FVⅢ:Ac水平明顯升高，而ADAMTS13:Ag水平則明顯降低,差異均有統計學意義（均P＜0.01）；肝硬化患者BMI指數明顯下降，差異有統計學意義（P＜0.01）；O血型和非O血型比例也存在統計學差異（P＜0.05）。

2.2 兩組O血型與非O血型亞組間臨床參數的比較 見表2。

由表2可見，與O血型肝硬化患者相比，非O血型患者血漿中 ALT、AST、TB、D-dimmer的水平及 VWF:Ag和F VⅢ:Ac水平有顯著的升高，差異均有統計學意義（均P＜0.05），而Fib及PLT水平則明顯的降低，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。與O血型健康對照組相比，非O血型健康對照組的ALT、AST、TB、D-二聚體的水平無明顯變化，差異無統計學意義（均P＞0.05），而VWF:Ag和F VⅢ:Ac水平明顯升高，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。兩組ADAMTS13:Ag水平在O血型與非O血型之間比較差異無統計學意義（均P＞0.05）。

表2 兩組O血型與非O血型亞組間臨床參數的比較

2.3 不同疾病程度肝硬化患者O血型與非O血型組間 VWF:Ag、F VⅢ:Ac、ADAMTS13:Ag的比較 根據CTP和MELD的評分等級，肝硬化患者組分別被分為亞組 Child A、Child B 和 Child C 及 Meld 1（≤7）和 Meld 2（＞7）[7]。與 Child A 肝硬化患者相比，Child C 肝硬化患者的VWF:Ag和F VⅢ:Ac水平明顯升高，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。與Meld 1肝硬化患者相比，Meld 2肝硬化患者的VWF:Ag和F VⅢ:Ac水平明顯升高，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。此外，在CTP和MELD評分的亞組分析中，O血型與非O血型肝硬化患者的VWF:Ag和F VⅢ:Ac水平也存在相似的結果（均P＜0.05）。而無論CTP和MELD評分，ADAMTS13:Ag水平在O血型與非O血型肝硬化患者間無明顯變化，差異無統計學意義（P＞0.05），見圖 1、2。

3 討論

Hulstein等[8]和Stepanian等[9]報道在溶血、肝酶升高、血小板減少（HELLP）綜合征或子癇前期的孕婦中不同程度的內皮細胞急性激活后釋放異常龐大的VWF多聚體，在血漿中被ADAMTS13酶在A2域分解成小的VWF多聚體，從而引起VWF水平的增高和ADAMTS13水平的降低。我們的結果顯示，與健康對照組相比，肝硬化患者肝臟內皮細胞的損傷引起VWF:Ag與F VⅢ:Ac水平的升高和ADAMTS13:Ag水平的降低（表1）。在血漿ADAMTS13缺乏的情況下，累積的VWF的多聚體表現出更加生物的活性，在高剪切應力的條件下誘導血小板聚集微血栓形成，從而促進了靜脈微循環的障礙[10]。而肝硬化患者ADAMTS13:Ag的降低可能是由于其被升高VWF:Ag水平的降解及肝臟星狀細胞釋放ADAMTS13:Ag水平的減少；患者F VIII:Ac水平的升高可能是由于VWF作為FVIII因子的載體，保護了F VIII不受蛋白水解酶的降解[11]。

圖1 根據C T P評分等級的分組，肝硬化患者F VⅢ:A c（a）、V W F:Ag（b）及 ADA M T S13:Ag（c）在 O 血型與非 O 血型組間的比較

圖2 根據M ELD評分等級的分組，肝硬化患者F V III:A c（a）、V W F:Ag（b）及ADA M T S13:Ag（c）在O血型與非O血型組間的比較

Danyelle等[12]提出非O血型的血液透析患者血漿VWF:Ag被ADAMTS13酶分解的速率明顯低于O血型患者VWF:Ag的分解速率。因此，非O血型的患者具有相對較高的VWF:Ag和F VIII:Ac水平，導致血栓栓塞的風險增大。本研究顯示非O血型肝硬化患者存在顯著升高的VWF:Ag水平和 F VIII:Ac（表2），甚至在CTP和MELD評分亞組分析中存在相似的結果。可能是由于非O血型肝硬化患者肝臟內皮細胞的損傷釋放大量的VWF多聚體；也可能是因為血漿VWF的N-聯寡糖和a2-巨球蛋白表達ABO血型抗原，而VWF的A、B抗原結構以共價鍵與VWF的N-聯寡糖相結合，保護VWF免受ADAMTS13酶的降解，從而引起明顯升高的VWF水平[13]。相反，O血型肝硬化患者因缺乏A、B抗原而表現出相對低水平的VWF:Ag。因此相對于O血型肝硬化患者，非O血型的患者存在更高水平的VWF:Ag，從而促進了患者靜脈微循環障礙或高凝狀態的形成。

然而，ADAMTS13:Ag在O血型與非O血型肝硬化患者間不存在明顯的差異，可能是因為肝硬化患者肝臟星狀細胞釋放少量的ADAMTS13，其水平的變化超過或掩蓋了ABO血型對ADAMTS13的影響。健康對照組人群中ADAMTS13:Ag水平在O血型與非O血型間的比較也無統計學意義，可能是由于標本數量的局限性導致VWF和ADAMTS13平衡的代償機制沒有發揮重要的意義。

CTP和MELD的評分已經廣泛用于評估肝硬化患者肝臟疾病的嚴重程度[7]。隨著肝臟疾病損傷嚴重程度的增加，VWF:Ag和F VⅢ:Ac水平均存在遞增的趨勢（圖1、2），而且O血型或非O血型的患者分別存在相似的遞增趨勢。在CTP和MELD評分的亞組中非O血型患者VWF:Ag水平及F VⅢ:Ac明顯高于O血型患者的水平，表明非O血型患者的肝臟損傷比O血型患者更加的嚴重，易引起微循環障礙而導致靜脈血栓等并發癥的發生。以往文獻報道[14-15]血漿中ALT、AST、TB與肝臟疾病的嚴重程度呈正相關，而D-二聚體和Fib呈負相關，且非O血型肝硬化患者存在升高的ALT、AST、TB和D-二聚體及降低的Fib和 PLT（表 2）。從而更進一步證實了非O血型肝硬化患者肝臟損傷程度較O血型患者更加的嚴重。

綜上所述，非O血型肝硬化患者存在升高的VWF:Ag水平和F VⅢ:Ac，且易形成靜脈微循環障礙狀態，其病情的發展較O血型患者更加的嚴重，并可誘發相關肝硬化并發癥，如靜脈血栓等。因此，為了降低非O血型肝硬化患者病情進一步發展的風險，建議患者定期的門診隨訪而采取一些有效的防治措施。