一株豬丹毒桿菌分離株致病性與耐藥性分析

王方珍 （山東省諸城市畜牧獸醫管理局 262200）

豬丹毒桿菌是一個可寄存于哺乳類動物，家禽和魚群的歷史悠久的病原，更甚于感染至人類。豬丹毒桿菌發生感染可導致豬急性或者亞急性敗血癥、皮膚壞死、心內膜炎等惡疾。近年來，我國及亞洲部分地區豬丹毒時有發生，給我們敲醒警鐘，豬丹毒桿菌的毒性及耐藥性或許發生變化。諸多學者擔憂疫苗還能否有效抵抗豬丹毒的攻擊。對臨床發病豬進行鑒定、測試、分析，確定所分離細菌為豬丹毒桿菌，并以小鼠進行毒菌及疫苗抗力試驗，目的是為了為豬丹毒的預防和治療提供科學依據。

1 樣本及方法

1.1 病原體及疫苗

某養豬場捐病豬 （肝、心、肺等器官），豬丹毒桿菌疫。

1.2 分離純化細菌

從病體各組織中提取無菌樣本置于恒溫中培養、觀察。選取可疑菌種培養并儲存。

1.3 菌株染色分離鏡撿

提取菌種涂片、染色并觀察。

1.4 試驗對象

健康小鼠。

1.5 引物設計及PCR測試

（1）引物設計； （2）提取菌種DNA； （3）煮沸法制作DNA模板，選取多個菌落放置于100μl的ddH2O的EP管中；（4）PCR聚合酶鏈式反應。

1.6 藥敏試驗

抑菌圈直徑<10mm不敏感 (耐藥)，10～20mm中度敏感，>20mm高度敏感。

1.7 用小鼠進行致病性細菌試驗

將菌株分離純化再與5%犢牛血清的營養肉湯稀釋，用麥氏標準比濁管估算活菌數。再取一定數量的小鼠進行試驗；最后用Reed-Muench法計算小鼠的半數致死量 (LD50)；并對死亡小鼠進行剖檢觀察。

1.8 試驗豬丹毒疫苗對小鼠的免疫保護作用

分別取兩組小鼠進行免疫和攻毒試驗，在一定時間內，對小鼠的體重、精神狀態及死亡情況等進行記錄、分析，結果見附圖。

2 試驗結論

（1）細菌的形狀。在血瓊脂平板培養24～48h后，出現纖細、針尖大小、露珠樣、半透明、表面光滑、邊緣整齊的白色小菌落，有α溶血現象；在含5%小牛血清的營養肉湯中培養20h后出現渾濁。分離菌株經革蘭染色鏡檢，在新培養基中，細菌呈典型的革蘭陽性、長短不一、有彎曲的桿菌，培養超過24h，細菌有長絲狀。

（2）細菌16SrRNA基因的PCR擴增為豬丹毒桿菌。

（3）進行豬丹毒桿菌和豬丹毒疫苗株G410T的藥敏試驗。

（4）檢測豬丹毒桿菌的耐藥基因，分離豬丹毒桿菌存在氨基糖苷類耐藥基因和四環素耐藥基因。

（5）試驗細菌的致病性。

（6）試驗豬丹毒弱疫苗的免疫攻毒保護性。

3 結論

通過從發病豬組織中分離并純化得到細菌，并通過驗證細菌的經形態特征、染色特性及PCR鑒定，最終確定為豬丹毒桿菌。并通過小鼠的試驗證明豬丹毒桿菌的致病性。

豬丹毒桿菌的出現一定會造成抗生素的使用，而其耐藥性會影響細菌感染后的治療。在豬丹毒桿菌的耐藥基因檢測顯示，豬丹毒桿菌包括疫苗株中存在氨基糖苷類aacC2、四環素類耐藥基因tetB，但沒有檢測到四環素耐藥基因tetA。同時，豬丹毒桿菌對β-內酰胺類抗生素有嚴重的敏感性。所以，豬場暴發疫情后的治療首選藥應為β-內酰胺類抗生素。但在臨床用藥時藥敏試驗高敏的藥物還不能完全達到預期效果。

附圖 小鼠免疫和攻毒后的平均體重

最后，豬丹毒疫苗免疫試驗結果表明，疫苗對小鼠是安全的，但由于本菌攻毒試驗沒有在豬上進行，為了不造成不必要的經濟損失，對豬丹毒的安全性有待進一步驗證。