日照市豬A型口蹄疫檢測(cè)與疫情風(fēng)險(xiǎn)分析

劉峰

（山東省日照市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 276800）

日照市位于蘇魯交界的黃海之濱，為國(guó)家膠東半島免疫無(wú)口蹄疫緩沖區(qū)。為了解全市豬A型口蹄疫疫情風(fēng)險(xiǎn)，2018年3月日照市根據(jù)全省統(tǒng)一部署開(kāi)展了對(duì)養(yǎng)殖場(chǎng)、屠宰場(chǎng)和無(wú)害化處理廠的專項(xiàng)調(diào)查。通過(guò)深入養(yǎng)豬場(chǎng)查看和流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，豬群整體狀況良好，無(wú)口蹄疫癥狀。在未免疫豬A型口蹄疫疫苗的豬場(chǎng)采集了豬血樣60份，進(jìn)行豬A型口蹄疫液相阻斷ELISA抗體檢測(cè)，未檢測(cè)到A型口蹄疫抗體；采集了屠宰場(chǎng)、無(wú)害化處理廠豬淋巴結(jié)和扁桃體各60份，進(jìn)行豬口蹄疫病毒熒光RT-PCR試驗(yàn)，結(jié)果均為陰性。綜上所述，日照市目前未發(fā)現(xiàn)豬A型口蹄疫病例，但如果疏于日常管理也可能導(dǎo)致疫情發(fā)生。

1 檢測(cè)

1.1 豬A型口蹄疫液相阻斷ELISA抗體檢測(cè)試驗(yàn)

檢測(cè)依據(jù)∶GB/T18935-2003。

1.1.1 樣品概述

采集自未免疫豬A型口蹄疫疫苗的豬場(chǎng)，豬只前腔靜脈采血，離心收集血清60份，液體、澄清、淺黃色。

1.1.2 主要儀器

全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（MultiskanGO，美國(guó)賽默飛）、電熱恒溫干燥箱（GZX_9140，上海博迅）、超純水儀（Cascada，美國(guó)PALL）， 移液器（Biohit， 芬蘭百得）。

1.1.3 診斷試劑

蘭州獸醫(yī)研究所生產(chǎn)的口蹄疫A型液相阻斷ELISA抗體檢測(cè)試劑盒，批號(hào)：20170906103-2。

1.1.4 檢驗(yàn)室環(huán)境

溫度：25℃，濕度：55%。

1.1.5 檢測(cè)時(shí)間

20180323-20180324。

1.1.6 主要操作步驟

（1）抗原抗體反應(yīng)：在U型血凝板上將待檢血清從1∶16倍比稀釋至1∶128，然后每空加稀釋的病毒抗原50ul，封板，4℃過(guò)夜。（2）ELISA板洗5次，將抗原抗體混合物50ul移至ELISA板上，37℃1h。（3）洗5次，加入50ul豚鼠抗血清，37℃30min。（4） 洗5次， 加入50ul酶結(jié)合物，37℃30min。（5） 洗5次， 加入50ul底物， 37℃15min。（6） 加入50ul終止液，立即在450nm波長(zhǎng)讀取光吸收值。

1.2 豬口蹄疫病毒熒光RT-PCR檢測(cè)試驗(yàn)

檢測(cè)依據(jù)∶GB/T27528-2011。

1.2.1 樣品概述

采集自屠宰場(chǎng)、無(wú)害化處理廠的豬淋巴結(jié)和扁桃體各60份，固體、組織。

1.2.2 主要儀器

II級(jí)生物安全柜（AC24，新西蘭）、熒光RT-PCR儀（7500， 美國(guó) ABI）、 移液器（Biohit,芬蘭百得）。

1.2.3 診斷試劑

北京生科生產(chǎn)的豬口蹄疫病毒熒光RT-PCR試劑盒，批號(hào)： 20170901。

1.2.4 檢驗(yàn)室環(huán)境

溫度：25℃，濕度：55%。

1.2.5 檢測(cè)時(shí)間

2018年3月25日至2018年3月26日。

1.2.6 主要操作程序

（1）樣品處理：稱樣品1g,用手術(shù)剪刀剪碎混勻后取0.05g于研磨缽中研磨，加入1.5ml生理鹽水繼續(xù)研磨，待勻漿后轉(zhuǎn)至1.5ml滅菌離心管中，8000rpm離心2min，取上清200ul置于1.5ml滅菌離心管中。

（2）病毒模板RNA提取：收集200ul樣品或陰陽(yáng)性對(duì)照，加入1.5ml滅菌離心管中；加200ulBufferV-L，漩渦振蕩混合均勻，靜置5min；75ulBufferV-N，A漩渦振蕩混合均勻，12000×g離心5min；將上清液轉(zhuǎn)移到新的2ml離心管中，加300ul異丙醇，上下倒置6～8次，混合均勻；將植被管置于2ml離心管中，取上一步的混合液移入植被管，6000×g離心1min；將植被管置回到2ml離心管中，12000×g離心1min，將植被管置于清潔的1.5ml離心管中，在植被管膜中央加60ul-BufferTE，室溫靜置1min，12000×g離心1min，洗脫RNA。

（3）反應(yīng)液配制：反應(yīng)體系按照RT-PCR反應(yīng)液15ulTab酶0.25ul進(jìn)行配制，每個(gè)反應(yīng)管中加入上述反應(yīng)體系15ul，加樣10ul，放入儀器中。

（4） 熒光 RT-PCR 反應(yīng)： 42℃30min； 92℃3min； 92℃10s， 45℃30s， 72℃1min， 5個(gè)循環(huán)； 92℃10s， 60℃30s， 40個(gè)循環(huán)，熒光收集設(shè)備在第四階段每次循環(huán)退火延伸時(shí)進(jìn)行。

2 結(jié)果

根據(jù)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)，被檢測(cè)的60份樣本中未檢測(cè)到A型口蹄疫抗體，詳見(jiàn)表1。

根據(jù)結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)，120份被檢測(cè)樣本中未發(fā)現(xiàn)口蹄疫病毒，詳見(jiàn)表2。

3 分析

本次檢測(cè)受檢測(cè)時(shí)間和樣本數(shù)量限制，代表廣泛性不是很強(qiáng)。但通過(guò)對(duì)調(diào)查問(wèn)卷中的飼養(yǎng)情況、調(diào)運(yùn)檢疫情況、疫苗接種情況統(tǒng)計(jì)和養(yǎng)豬場(chǎng)的地理位置、疾病防治、消毒、用藥、發(fā)病史、發(fā)病數(shù)、環(huán)境衛(wèi)生狀況分析，結(jié)合實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)數(shù)據(jù)，可以認(rèn)為日照市未發(fā)現(xiàn)豬A型口蹄疫病例，但存在可能導(dǎo)致疫情發(fā)生的諸多不安全隱患。

表2 豬口蹄疫病毒熒光RT-PCR檢測(cè)試驗(yàn)結(jié)果

（1）個(gè)別養(yǎng)殖戶管理不規(guī)范，檔案記錄不全。豬有病不能及時(shí)發(fā)現(xiàn)，死豬后不能及時(shí)無(wú)害化處理，疫情不按時(shí)上報(bào)。特別是對(duì)豬口蹄疫危害認(rèn)識(shí)不足，及時(shí)免疫不規(guī)范。

（2）個(gè)別散養(yǎng)戶豬場(chǎng)消毒設(shè)施設(shè)備不全，車輛人員隨便出入，場(chǎng)區(qū)不能按時(shí)消毒。

（3）新引進(jìn)的豬只不進(jìn)行隔離觀察和口蹄疫檢測(cè)，存在引進(jìn)陰性帶毒個(gè)體的風(fēng)險(xiǎn)性。

（4）大部分養(yǎng)殖場(chǎng)不能及時(shí)進(jìn)行免疫抗體檢測(cè)，不能主動(dòng)進(jìn)行特種疫病凈化。

（5）畜禽交易、屠宰、產(chǎn)品加工等場(chǎng)所的排污、環(huán)境消毒等環(huán)節(jié)，缺少有效監(jiān)管。

4 建議

（1）大力宣傳口蹄疫的危險(xiǎn)性和危害性，強(qiáng)化以消毒滅源為主的生物安全防范措施，抓好養(yǎng)殖場(chǎng)日常管理。

（2）繼續(xù)做好牛羊O/A型和豬O型口蹄疫疫苗強(qiáng)制免疫工作，并及時(shí)補(bǔ)免。

（3）定期開(kāi)展實(shí)驗(yàn)室抗體監(jiān)測(cè)和疫病檢測(cè)，及時(shí)發(fā)現(xiàn)隱患，加強(qiáng)動(dòng)物疫情測(cè)報(bào)與信息交流。

（4）加強(qiáng)檢疫監(jiān)督。強(qiáng)化產(chǎn)地檢疫、屠宰檢疫和調(diào)運(yùn)監(jiān)管，嚴(yán)防輸入性疫病的發(fā)生。

（5）通過(guò)優(yōu)惠政策扶持養(yǎng)殖場(chǎng)主動(dòng)進(jìn)行特種疫病凈化，提高病死畜禽的無(wú)害化處理率，及時(shí)消滅疫病傳染源。