種公豬精液攜帶繁殖障礙相關(guān)病原調(diào)查

楊永能楊培昌*陶鑫趙謙楊超汪向民

（1，云南省楚雄州動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 675000；2，云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 650201）

豬繁殖障礙性疾病是一類主要導(dǎo)致妊娠母豬流產(chǎn)、產(chǎn)死胎、弱胎、木乃伊胎及公豬生精功能下降等為主要特征的疫病，該類疫病的存在給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失。隨著養(yǎng)殖業(yè)的進(jìn)一步發(fā)展，多種病因引起的混合感染讓豬繁殖障礙病因越來越復(fù)雜，防治越來越困難。其中，豬繁殖與呼吸綜合征 (PRRS)、豬瘟 (CSF)、豬圓環(huán)病毒 2型(PCV-2)、豬細(xì)小病毒 (PPV)、偽狂犬病 (PR)、豬乙型腦炎 (JE)均可引起豬群繁殖障礙性疾病，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。

豬人工授精技術(shù)的推廣與應(yīng)用使疫病經(jīng)精液傳播的風(fēng)險(xiǎn)大大提高。所以，公豬健康及其精液品質(zhì)安全對(duì)生豬疾病防控起關(guān)鍵作用[1]。為全面了解楚雄州種豬精液攜帶繁殖障礙相關(guān)病毒性病原狀況，此次調(diào)查采集27個(gè)種豬精液供應(yīng)點(diǎn)93份不同種公豬精液樣品進(jìn)行病原學(xué)檢測(cè)，現(xiàn)將檢測(cè)情況及結(jié)果報(bào)告如下。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源

精液樣品采集自：2017年8月至2018年2月楚雄州九縣（市）共27個(gè)種豬精液供應(yīng)點(diǎn)，共計(jì)93份不同種公豬精液樣品。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

超凈工作臺(tái)、-20℃低溫冰箱、各種量程的移液槍、電子天平、速冷凍離心機(jī)、PCR儀、電泳儀、電泳槽、全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)、手提式高壓蒸汽滅菌壓力鍋、恒溫水浴振蕩器。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑

RNAiso Plus Total RNA、Bioteke細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒、 RI Enzyme Mix、 2×ES Reaction Mix、 2×Trans Taq HiFiPCR Super Mix、異丙醇、75%乙醇、瓊脂粉、TAE緩沖液、雙蒸水、氯仿等。

1.1.4 PCR引物合成

參照相關(guān)序列使用primer premier 5.0軟件設(shè)計(jì)所用引物，并在Blast上進(jìn)行比對(duì)后送往上海生物工程有限公司合成。具體引物序列見表1。

1.2 方法

1.2.1 核酸提取

使用RNAiso Plus Total RNA和細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒對(duì)樣品分別進(jìn)行RNA和DNA的提取，提取過程嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

1.2.2 目的基因片段擴(kuò)增

（1）豬繁殖與呼吸綜合征病毒 (PRRSV)、豬乙型腦炎病毒（JEV）和豬瘟病毒（CSFV）RT-PCR擴(kuò)增。將上述提取出來的樣品RNA利用特異性引物對(duì)其進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，反轉(zhuǎn)錄體系如下：2×ES Reaction Mix(含 10×RT Buffer， dNTPs)5ul， EasyScriptTMⅡ RT/RI Emzyme Mix(含Rnase Inhibitor，反轉(zhuǎn)錄酶)0.5ul，下游引物1ul，模板RNA 3.5ul，反應(yīng)體系為10ul。將配制好的體系置于 42℃反應(yīng)30min，之后85℃反應(yīng)5min。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物置于4℃保存?zhèn)溆谩?PCR 擴(kuò)增體系為： Mix(含 10×PCR buffer， dNTPs，TransTaq酶) 12.5ul，dH2O 10.5ul，上游引物和下游引物各 0.5ul，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（cDNA）1ul，總反應(yīng)體系為 25ul。PRRSV擴(kuò)增反應(yīng)條件為：94℃ 3min；94℃ 1min，65℃1min，72℃ 1min，40個(gè)循環(huán)；72℃ 5min。JEV擴(kuò)增反應(yīng)條件為： 94℃ 5min； 94℃ 40s， 56℃ 40s， 72℃ 40min， 35個(gè)循環(huán)；72℃ 5min。CSFV第一輪擴(kuò)增反應(yīng)條件為：94℃ 5min；94℃ 30s， 53℃ 45s， 72℃ 50s， 34 個(gè)循環(huán)； 72℃ 5min。 將所得到的第一輪產(chǎn)物稀釋300倍后進(jìn)行第二輪擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：94℃ 5min； 94℃ 40s， 56℃ 40s， 72℃ 40s， 34 個(gè)循環(huán)； 72℃5min。取10ul PCR擴(kuò)增產(chǎn)物配制成體系后加樣到1.5%瓊脂糖凝膠（含0.2%EB）孔中，并在100V電壓下進(jìn)行40min的電泳，在凝膠成像系統(tǒng)上觀察結(jié)果，并拍照。

（2）豬圓環(huán)病毒 2型（PCV-2）、豬細(xì)小病毒（PPV）和偽狂犬病毒（PRV）PCR擴(kuò)增。將上述提取出來的樣品DNA利用特異性引物對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增體系為 ： Mix(含 10×PCRbuffer， dNTPs， TransTaq 酶 )12.5ul，dH2O 10.5ul，上下游引物各0.5ul，DNA 1ul，總反應(yīng)體系為 25ul。PCV-2擴(kuò)增反應(yīng)條件為：94℃ 5min；94℃ 30s，60℃ 40s，72℃ 40s，35次循環(huán)；72℃ 7min。PRV擴(kuò)增反應(yīng)條件為： 94℃ 5min； 94℃ 30s， 59℃ 35s， 72℃ 40s， 35個(gè)循環(huán)；72℃ 5min。PPV擴(kuò)增反應(yīng)條件為：94℃ 5min；94℃1min， 60℃ 1min， 72℃ 1min， 30次循環(huán)； 72℃ 7min。 取10ul PCR擴(kuò)增產(chǎn)物配制成體系后加樣到1.5%瓊脂糖凝膠（含0.2%EB）孔中，并在100V電壓下進(jìn)行40min的電泳，在凝膠成像系統(tǒng)上觀察結(jié)果，并拍照。

表1 6種病毒引物序列表

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 種公豬精液六種繁殖障礙性病毒性病原檢測(cè)結(jié)果

對(duì)來自云南楚雄州九縣 (市)地區(qū)共計(jì)93份精液樣品分別進(jìn)行豬繁殖與呼吸綜合癥病毒（PRRSV）、豬瘟病毒（CSFV）、豬圓環(huán)病毒2型（PCV-2）、偽狂犬病毒（PRV）、豬細(xì)小病毒（PPV）和豬乙型腦炎病毒（JEV）檢測(cè)，結(jié)果為93份樣品中檢測(cè)出了8份豬繁殖與呼吸綜合癥病毒（PRRSV）陽性8份，陽性率為8.6%(8/93)；檢測(cè)出豬瘟病毒（CSFV）陽性0份，陽性率為0%(0/93)；檢測(cè)出豬圓環(huán)病毒 2型（PCV-2）陽性18份，陽性率為19.35%(18/93)；檢測(cè)為偽狂犬病毒（PRV）陽性1份，陽性率為1.08%(1/93)；檢測(cè)出豬細(xì)小病毒（PPV）陽性0份，陽性率為0%(0/93)，檢測(cè)出豬乙型腦炎病毒（JEV）陽性0份，陽性率為0%(0/93)。具體見表2。

2.2 6種繁殖障礙性病毒性病原檢測(cè)結(jié)果電泳圖

詳見圖1～圖6電泳圖。

3 討論

3.1 PCR方法可作為精液中攜帶病原最快捷準(zhǔn)確的檢測(cè)方法之一

PCR技術(shù)具有簡(jiǎn)單、快捷、特異性好、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，作為目前疫病監(jiān)測(cè)的重要方法之一，被廣泛應(yīng)用于病毒診斷和流行病學(xué)調(diào)查。此次采用PCR與RT-PCR方法對(duì)云南楚雄地區(qū)多個(gè)供精點(diǎn)的精液攜帶繁殖障礙相關(guān)病原進(jìn)行檢測(cè)，在實(shí)驗(yàn)過程中PCR檢測(cè)方法快捷，結(jié)果準(zhǔn)確，靈敏，可靠。

3.2 精液中的病源傳播不容小視

近年來，隨著豬人工授精技術(shù)的廣泛推廣與應(yīng)用，種豬精液的品質(zhì)安全對(duì)養(yǎng)殖業(yè)疫病防控至關(guān)重要。科學(xué)研究表明，病毒可以通過公豬精液傳染給豬群，其中危害最大的疫病是病毒性疾病，這類疫病主要包括豬繁殖與呼吸綜合征 (PRRS)、豬瘟 (CSF)、偽狂犬病 (PR)、豬圓環(huán)病毒2型 (PCV-2)、乙型腦炎 (JE)、豬細(xì)小病毒 (PPV)等等[2]。有資料表明，種公豬在感染豬繁殖與呼吸系統(tǒng)綜合癥病毒(PRRSV)后第4天即可從精液中檢測(cè)到PRRSV病毒顆粒，而種公豬外表不表現(xiàn)出任何臨床癥狀[3]。這些疾病主要導(dǎo)致妊娠母豬繁殖障礙，而這些疫病不但能通過水平和接觸傳播，還能通過公豬精液垂直傳播[4]，攜帶病原的種公豬通過精液將病原傳給母豬，母豬妊娠后可將自身感染的病原通過胎盤屏障傳染給胎兒，造成新生仔豬感染，進(jìn)而造成疫情擴(kuò)散與流行。因此，加強(qiáng)對(duì)供精站點(diǎn)種豬精液帶毒檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)并及時(shí)淘汰帶毒種公豬，銷毀帶毒精液，從而及時(shí)消滅疫病傳染源，對(duì)防范和控制豬繁殖障礙性疫病的傳播與流行具有重要作用。

表2 6種繁殖障礙性病毒性病原檢測(cè)結(jié)果

圖1 豬圓環(huán)病毒2型（PCV-2）電泳圖（部分）

圖2 豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）電泳圖（部分）

圖3 偽狂犬病毒（PRV）電泳圖（部分）

圖4 豬瘟病毒（CSFV）電泳圖（部分）

圖5 豬細(xì)小病毒（PPV）電泳圖

圖6 豬乙型腦炎病毒（JEV）電泳圖

3.3 加強(qiáng)對(duì)供精站點(diǎn)公豬精液的監(jiān)管刻不容緩

從調(diào)查結(jié)果可以看出，檢測(cè)的93份精液樣品中27份精液樣品攜帶繁殖障礙相關(guān)病原，綜合陽性率高達(dá)29.03%。其中豬繁殖與呼吸綜合癥病毒（PRRSV）陽性8份，陽性率為8.6%；豬圓環(huán)病毒2型（PCV-2）陽性18份，陽性率為19.35%；偽狂犬病毒（PRV）陽性1份，陽性率為1.08%。尚未發(fā)現(xiàn)混合感染的情況。檢測(cè)結(jié)果陽性帶毒公豬通過精液傳播疫病的風(fēng)險(xiǎn)較大，如不及時(shí)淘汰帶毒公豬，可能造成疫病傳播與流行。因此，相關(guān)監(jiān)管部門應(yīng)定期加強(qiáng)對(duì)供精站點(diǎn)公豬精液的監(jiān)管刻不容緩。

3.4 公豬精液帶毒與豬發(fā)病的關(guān)系

此次采集精液的種公豬均來自各供精站點(diǎn)品種優(yōu)良、外觀健康未發(fā)現(xiàn)任何發(fā)病的種公豬，但通過種豬精液樣品檢測(cè)結(jié)果可知，部分種豬存在攜帶PRRSV、PCV-2、PRV，攜帶病原的種公豬并未表現(xiàn)出發(fā)病癥狀，很難被肉眼識(shí)別。由此說明，公豬精液帶毒與豬只發(fā)病不存在直接聯(lián)系。因此，定期對(duì)種豬精液采用實(shí)驗(yàn)室方法進(jìn)行檢測(cè)尤為重要。