植物核糖體失活蛋白研究進(jìn)展

黃夢琦, 周 嫻, 李婧姝,郭詩華,崔永紅

(1.福建農(nóng)林大學(xué),福建 福州 350002；2.千景空間科技有限公司，貴州 貴陽 550004；3.福建省林業(yè)調(diào)查規(guī)劃院, 福建 福州 350003)

19世紀(jì)末，首個核糖體失活蛋白從蓖麻(Ricinuscommunis L.)種子中分離出來，Matthew J walsh 證明其是一類抑制蛋白質(zhì)合成的不可逆催化毒素[1]。目前RIPs已構(gòu)成一類具有特征性的家族毒素，其中大部分由植物體分泌產(chǎn)生，包括自18種單子葉植物、122種雙子葉植物等被子植物綱中的350余種植物中檢測分離出的110多種RIPs[2]。

病原真菌、生物蟲害是影響我國農(nóng)作物產(chǎn)量和品質(zhì)的重要因素之一。大面積使用高效內(nèi)吸性殺菌劑，使植物病害的防治取得突破性進(jìn)展，同時也導(dǎo)致病原菌對藥劑的抗性問題日益突出。半個多世紀(jì)的研究表明[3]，植物體內(nèi)RIPs的有效表達(dá)使其具有抗病原菌、抗生物蟲害等功能，因而受到人們普遍關(guān)注[4]。

圖1 核糖體失活蛋白的類型

1 核糖體失活蛋白研究概況

1.1 核糖體失活蛋白的種類

根據(jù)分子結(jié)構(gòu)的差異特性,可將RIPs分為3類(圖1)，簡稱Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅱ型。

Ⅰ型RIP是一種單鏈蛋白質(zhì)，其分子量約為30kDa，多為堿性糖蛋白,具有RNA-N-甘氨酸酶活性,在活性位點區(qū)域內(nèi)存在高度保守的活性裂隙殘基和次級結(jié)構(gòu)，如天花粉蛋白(Trichosanthin,TCS)、絲瓜毒蛋白(luffin)、美洲商陸抗病毒蛋白等。Ⅱ型RIPs由酶促活性A鏈和稍大的B鏈組成，對半乳糖結(jié)構(gòu)的糖類呈現(xiàn)特異性[5]，是分子量約為65 kDa的二聚體蛋白。A鏈具有核糖體失活蛋白活性，與Ⅰ型RIP功能相似,B鏈?zhǔn)菍Π肴樘菍Ｒ坏哪兀哂心钚浴、B兩鏈通過二硫鍵相連，劇烈的疏水作用使其結(jié)合在一起。除了這兩種典型的RIPs，從大麥(Hordeumvulgare)中檢測分離出的一種JIP60的RIP(分子量大小約60 kDa)被稱為Ⅲ型RIPs，它包含類似于I型RIPs的氨基末端結(jié)構(gòu)域，先合成無活性的前體，經(jīng)酶解加工后成為有活性的RIP[6,7]。該型RIPs并不常見，到目前為止，僅在大麥(JIP60)和玉米(b-32)這兩種農(nóng)作物中檢測分離出Ⅲ型RIP。

1.2 核糖體失活蛋白的分布

核糖體失活蛋白在植物體內(nèi)的含量較高，但規(guī)律性不強(qiáng)。除在少數(shù)幾種細(xì)菌和真菌中發(fā)現(xiàn)RIPs外，其余幾乎都來源于高等植物。Ⅰ型、Ⅱ型RIPs常位于植物的葉子、種子或根部，并且單鏈Ⅰ型RIP比Ⅱ型RIP更常見。有趣的是，Ⅰ型RIP如美洲商陸抗病毒蛋白和天花粉蛋白，其毒性低于Ⅱ型RIP如相思豆毒素和蓖麻毒蛋白，而這種毒性減弱的主要原因是Ⅰ型RIP不結(jié)合B鏈。當(dāng)然，自然界也存在一些無毒性的Ⅱ型RIPS。植物的不同時期、不同組織部位，RIPs分布也存在差異,成熟種子中RIPs活力相對較高。

2 核糖體失活蛋白的應(yīng)用領(lǐng)域

2.1 RIPs在植物保護(hù)中的應(yīng)用

近年的研究已表明：植物基因編碼翻譯的RIPs對生物病害具有一定抗性，包括廣譜性抗病毒、抗真菌甚至對昆蟲也有一定抗性[8]，這也決定了RIPs具有失活自身核糖體、殺死自身細(xì)胞的可能性。為避免“自殺行為”的發(fā)生，RIPs進(jìn)化出一套植物自身防御機(jī)制：RIPs以不具活性的前體存在，必要時再加工為活性狀態(tài)，有活性的RIPs與自身核糖體是分離的。RIPs在老葉中含量增多，當(dāng)植物衰老或遭受外界環(huán)境壓力時，RIPs會被誘導(dǎo)或活性增加。這極有可能也是一種植物自身防御的機(jī)制。

RIPs的廣譜抗性還體現(xiàn)在對昆蟲的抑制、毒殺作用中。不同昆蟲對RIPs的敏感性有所差異。低濃度的肥皂草素(Saporin)、蓖麻毒蛋白(Ricin) 可使翹翅目的棉鈴象甲(Anthonomusgrandis)和四紋豆象(Callosobruchusmaculatus)死亡，但對鱗翅目的棉貧夜蛾(Spodopteralittoralis)和煙芽夜蛾(Heliothisvirescans)無明顯作用。對昆蟲產(chǎn)生作用的RIPs多為Ⅰ、Ⅱ型，這是由于Ⅱ型RIPs B鏈、部分I型RIPs具有凝集活性，可與昆蟲細(xì)胞的特異性受體結(jié)合，對昆蟲產(chǎn)生毒殺或抑制作用，可有效的保護(hù)植株不被蟲害所侵?jǐn)_。

2.2 核糖體失活蛋白在轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用

2.2.1 在轉(zhuǎn)基因小麥中應(yīng)用 植物病毒病是由植物病毒引起的一類重要病害,目前尚未有高效的抗病毒制劑。小麥作為世界上十大糧食產(chǎn)物之一，常受到各種病原病毒以及真菌危害。Balconi通過基因槍技術(shù)驅(qū)動玉米體內(nèi)的b-32基因，將其轉(zhuǎn)入小麥體內(nèi)而得到轉(zhuǎn)基因小麥，極大降低了FHB感染率，同時在其研究中提到，玉米b-32基因在小麥體內(nèi)可產(chǎn)生通常不產(chǎn)生的抗真菌蛋白質(zhì)，將小麥中最具破壞性的真菌病害被控制在顯著水平[9]。這些結(jié)果證實，玉米b-32基因的整合可能是保護(hù)作物對抗真菌疾病的有效工具。Shahidi-Noghabi等使用接骨木(Sambucusnigra)的2型核糖體失活蛋白SNA-10的基因轉(zhuǎn)化煙草植物，轉(zhuǎn)基因煙草對蚜蟲的生命參數(shù)，如存活率、凈繁殖率、平均世代時間均產(chǎn)生顯著影響[10]。該結(jié)果為RIPs對害蟲具有抗性提供了進(jìn)一步的支持。

2.2.2 在轉(zhuǎn)基因煙草中應(yīng)用 煙草是重要的葉用經(jīng)濟(jì)作物，但它在生長過程中常受到赤星病菌 (Alternariaalternata)、煙草花葉病毒(Tobaccomosaicvirus)等的侵害，致使煙草產(chǎn)量下降，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。Corrado等分析研究了PhRIPI的抗病毒活性，通過對PVX攻擊轉(zhuǎn)化的煙草(Nicotianatabacum)系，轉(zhuǎn)基因煙草與未轉(zhuǎn)化煙草相比病毒損傷數(shù)目顯著降低，表明抗病毒蛋白的受控基因表達(dá)可增加病毒抗性。

2.2.3 在其他轉(zhuǎn)基因植物中應(yīng)用 前人對使用基因工程手段改善植物的抗性進(jìn)行了深入研究，如利用植物的幾丁質(zhì)酶基因、利用植物的核糖體失活蛋白基因改善植物抗性等。在一些早期的以 RIP基因為目的基因的報道中，均是以煙草為受體植物進(jìn)行實驗，而近幾年轉(zhuǎn)RIP基因的受體植物已拓展至水稻、馬鈴薯等糧食作物。

郝文勝等通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化易感馬鈴薯植株、目的基因表達(dá)鑒定、相關(guān)抗病性鑒定，證實被轉(zhuǎn)化馬鈴薯植株基因組整合的RIP基因在轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)正常，且部分轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植株的蛋白提取物具有類似RIP基因產(chǎn)物的脫嘌呤活性[11]。

3 應(yīng)用前景及展望

目前，RIPs已被廣泛研究運(yùn)用，在植物中有效表達(dá)已經(jīng)變成重要的研究方向。在農(nóng)業(yè)方面，RIPs的研究取得許多進(jìn)展,但仍有很多問題無法解決：RIPs在植物中的表達(dá)活性如何有效提高；轉(zhuǎn)基因植物是否可以同時擁有天然植物所具有的獨特保護(hù)機(jī)制；RIPs作為免疫毒素所產(chǎn)生的副作用如何克服……但是一些RIPs對病原體和食肉動物，如真菌、細(xì)菌、病毒和昆蟲是有毒的。RIPs的生理功能是起防御作用，即抵抗病蟲害或惡劣環(huán)境，已有的轉(zhuǎn)基因?qū)嶒炚f明：導(dǎo)入RIP基因會使植物具有對真菌、病毒等的廣譜抗性。這為后續(xù)利用RIP基因進(jìn)行轉(zhuǎn)基因作物育種提供了一條可行的途徑。