SCID 小鼠臟器質量和部分血液生理生化及免疫指標測定

袁水娟, 施國君, 唐慧青, 施美蓮

(1. 上海交通大學, 上海 200240; 2. 上海靈暢生物科技有限公司, 上海 201402;3. 上海斯萊克實驗動物有限責任公司, 上海 201615)

嚴重聯合免疫缺陷(SCID)小鼠是一種先天性淋巴細胞免疫缺陷動物，純合的SCID基因特異性地阻礙了T和B淋巴細胞分化，使動物缺乏功能性的T和B淋巴細胞。它是Bosman等[1]于1983年在CB17近交系小鼠中發現的，比單純的T細胞缺乏的裸小鼠在腫瘤免疫研究方面更具有優越性，是研究腫瘤、免疫、病原體感染、生殖等方面極好的材料和動物模型。

鑒于SCID小鼠從國外引進以來，由于飼養環境及營養水平等與國外都有差異，這些因素都可能導致小鼠的遺傳性狀、生理生化等生物學特性發生改變。本文針對本公司飼養的SCID小鼠，測定了其主要臟器重量、血生理生化、免疫球蛋白、補體和免疫細胞數據，為利用該品系進行生物醫藥、腫瘤學等方面研究者提供基礎的生物學數據資料。

1 材料與方法

1.1 動物來源

在上海靈暢生物科技有限公司 [SCXK(滬)2013-0018] SPF級SCID小鼠第三代生產群中隨機抽取4周齡、8周齡、16周齡各20只(雌雄各半)用于動物臟器質量、血液生理生化、免疫蛋白和補體數據測定;隨機抽取8周齡20只(雌雄各半)用于免疫細胞數據測定。選取的動物采取隨機方式, 未進行滲漏檢測。

1.2 環境及飼養管理

實驗用小鼠飼養在上海靈暢生物科技有限公司隔離中，隔離器內的空氣為100級全新風, 室內溫度 22～26 ℃, 相對濕度為 40%～60%, 換氣次數每小時20次, 光照明暗各12 h∶12 h, 動物自由采食。

小鼠用飼料、墊料為上海普路騰生物科技有限公司提供[滬飼證(2014)04001]，經35 kGy60Co輻照，飼料的營養成分為: 粗蛋白24.5%～25.5%，粗脂肪5.5%～6.5%，粗灰分6.0%～6.5%，粗纖維4.0%～4.5%，水份≤10%，鈣1.2%～1.5%，磷0.75%～1.0%，賴氨酸≥1.32%，蛋氨酸+胱氨酸≥0.78%。飲用水為酸化過濾純水，pH值為2.5～3.5，并經121℃、40 min高壓蒸汽滅菌。墊料每周更換一次, 進出隔離器的物品均進行121 ℃,30 min消毒滅菌處理。

1.3 主要儀器

日立7020全自動生化分析儀、Eppendorf 5427R離心機、美國BD公司流式細胞儀、Mettler toledo AL104電子稱[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司，可讀性0.0001 g]; 手術剪、眼科鑷等常規手術器械。

1.4 實驗方法

1.4.1 臟器質量的測定 電子天平稱體質量后, 按動物體質量30 mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉, 眼眶靜脈采血后, 脫頸椎施行安死術。立即剖取心、肝、脾、肺、腎、腎上腺、胸腺、腦、睪丸、卵巢, 并用濾紙吸干組織表面水分, 稱取臟器重量。

1.4.2 血常規指標測定 取 20 μL全血加 500 μL稀釋液混勻, 用Sysmex KX-21N全自動血球分析儀檢測, 指標為白細胞計數(WBC)、紅細胞計數(RBC)、血紅蛋白(HGB)、血細胞壓積(HCT)、紅細胞平均體積(MCV)、紅細胞平均血紅蛋白(MCH)、紅細胞平均血紅蛋白濃度(MCHC)、血小板(PLT)、紅細胞體積分布寬度(R D W)、血小板平均容積(MPV)、血小板體積分布寬度(PDW)、淋巴細胞(LYM)、血小板大細胞比率(P-LCR)。

1.4.3 血液生化、免疫球蛋白和補體指標測定 取0.8 mL全血置離心管內，4 ℃冰箱內放置1 h后2 800× g離心10 min, 分離出血清，進行血液生化、免疫球蛋白、補體的測定。血液生化指標為總膽固醇(TCHO)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、丙氨酸轉氨酶(ALT)、天冬氨酸轉氨酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、血糖(GLU)、總尿素氨(BUN)、鈣(Ca)、磷(P)。免疫球蛋白和補體指標為IgG、IgA、IgM、C3、C4。

1.4.4 免疫細胞測定 動物處死后取脾臟，盡量去除附著其上的脂肪組織，放入淋巴細胞分離液，研磨，將分離液轉移至15 mL離心管內，覆蓋200～500 μL的1640培養基, 800 ×g離心30 min, 吸出淋巴細胞層, 再加入10 mL 1640培養基, 250 ×g離心10 min收集細胞，傾倒上清液，流式細胞儀細胞計數，測定T細胞及亞群、B細胞(B220+)、NK細胞(NK1.1+)。

1.5 統計學方法

實驗結果用軟件SPSS 19.0單因素方差分析分析, 數值以表示, P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SCID小鼠臟器質量

從表1可見, 4周齡SCID小鼠不同性別間心臟、肺臟、脾臟、腦、腎上腺、胸腺質量差異均沒有統計學意義。4周齡SCID小鼠的心臟、肺臟、肝臟、腎臟重量均顯著小于8周齡和16周齡小鼠。SCID小鼠的胸腺重量與性別、周齡均無關，各數據間無顯著差異。在8周齡時, SCID小鼠雌性和雄性的脾臟最小, 性別間存在顯著性差異。

表1 SCID小鼠臟器質量 mg

2.2 SCID小鼠血液生理指標

從表2可見，4周齡不同性別的SCID小鼠WBC，RDW-CV含量無顯著差異，而8周齡、16周齡在不同性別間有顯著差異。4周齡、8周齡、16周齡的SCID雌鼠MCH水平均顯著高于雄鼠。不同周齡SCID小鼠RBC、LYM含量，8周齡數值最低, 8周齡、16周齡均顯著低于4周齡。不同周齡不同性別的SCID小鼠在PLT、RDW-SD水平上無顯著差異。4周齡的SCID雌性、雄性鼠的PDW、MPV顯著低于8周齡和16周齡的小鼠。

2.3 SCID小鼠血液生化指標

從表3可見, 16周齡SCID雌性、雄性小鼠TG水平均顯著低于4周齡、8周齡雌性、雄性小鼠。8周齡、16周齡的SCID雌鼠LDL-C、ALP水平均顯著高于雄鼠, 而GLU顯著低于雄鼠。SCID雌性、雄性小鼠的Ca、P指標隨著周齡增長逐步降低趨勢。

表2 SCID小鼠血液生理指標

表3 SCID小鼠血液生化指標

2.4 SCID小鼠主要免疫球蛋白、補體指標

從表4可見，4周齡SCID小鼠的IgG、IgA、IgM水平顯著大于8周齡、16周齡的SCID的小鼠 。8周齡的SCID小鼠5項指標無性別上差異，而16周齡的SCID小鼠5項雄性顯著高于雌性。

2.5 SCID小鼠主要免疫細胞指標

CD3+在整體免疫細胞占比最小，而B220+占比最大。在性別上，T細胞、B細胞、NK細胞無顯著差異(表5)。

表4 SCID小鼠主要免疫球蛋白、補體指標

表5 SCID小鼠主要免疫細胞 %

3 討論

胸腺和脾臟是機體重要的免疫器官,其在一定程度上可以反映機體免疫功能的強弱。本文數據顯示，SCID小鼠胸腺質量是隨著周齡的上升也處于上升狀態, 但不存在顯著性差異, 說明小鼠胸腺的發育并不像正常非免疫缺陷小鼠那樣出生后快速生長，性成熟達到高峰，以后逐漸退化萎縮，和國內學者的數據相符[2]。16周齡SCID小鼠胸腺這一免疫器官質量并沒有萎縮, 可能說明SCID小鼠隨著周齡的增大, 免疫能力也在逐步地恢復，因而實驗中會出現滲漏現象[3]。8周齡的SCID小鼠雌性和雄性的脾臟質量最小，這提示在免疫學研究時要盡量使用8周齡左右的SCID小鼠。據資料顯示[4]，SCID小鼠6～8周齡的免疫滲漏率為5.5%, 17～19周齡為26.7%。

本實驗SCID小鼠生理結果與Charles River公司公布的2011年1～12月的8～10周齡的SCID小鼠數據基本相符，SCID小鼠生化數據中ALT、GLU偏低, 可能與動物營養有關。自1981年Siegel等[5]提出的“紅細胞免疫系統”概念，隨后許多學者對紅細胞免疫功能進行了系統的研究，表明它與白細胞都參與了免疫系統，兩者都具有多種免疫功能[6]。 實驗結果顯示，SCID小鼠WBC和RBC的含量隨著周齡增加而增加可能是SCID小鼠的滲漏現象使部分免疫細胞得以恢復，免疫功能增強，其自身的免疫缺陷隨著周齡的增加而自我恢復。實驗結果顯示SCID小鼠在RBC、LYM水平上，8周齡數值最低，8周齡、16周齡均顯著低于4周齡，也表明在8周齡時SCID小鼠免疫功能最為低下。本文測定的3個周齡段SCID小鼠免疫球蛋白和補體與免疫功能正常小鼠相比，其抗體含量IgG、IgA、IgM水平均遠低于正常小鼠的水平[7]，也證實SCID小鼠屬于T、B細胞免疫缺陷動物。

脾臟是機體最大外周免疫器官，占全身淋巴組織總量的25%，含有大量的淋巴細胞和巨噬細胞，是機體細胞免疫和體液免疫的中心, 其中T淋巴細胞占35%～50%，B淋巴細胞占50%～65%。本文通過對SCID小鼠脾臟免疫細胞測定，顯示在脾臟淋巴細胞中SCID小鼠T細胞含量最低，有活性的CD3+、CD4+、CD8+百分比含量很低，B細胞百分比含量最高，活性最高。此結果與外周血免疫細胞實驗結果相比[8], 脾臟細胞實驗中CD3+、B220+、NK1.1+明顯高于外周血的百分比含量，表明這些免疫細胞在脾細胞中百分比含量更高，尤其B細胞更為突出。

SCID小鼠作為T、B細胞免疫缺陷動物模型，目前在生物醫藥研究領域和人類腫瘤移植方面使用非常廣泛。本文通過對SCID小鼠主要臟器質量、血液生理生化、免疫球蛋白、補體及免疫細胞的測定與分析，可以為生產和研究單位更好地了解SCID小鼠的基礎生物學特性數據。同時本實驗測定的生理生化數據與國外SCID小鼠數據基本符合，也表明該品系自引種以來未發生生物學特性的明顯改變。