對健那綠跨膜運輸問題的理論分析

何金華 周紅霞 顧影影 李明凱* 王愛民 朱永元

（1 江蘇省濱海中學 江蘇濱海 224500 2 江蘇師范大學生命科學學院 江蘇徐州 221116 3 濱海縣人民醫院 江蘇濱海 224500）

活性染色是指利用某些無毒或毒性較小的染色劑顯示細胞內某些天然構造存在的真實性，而不影響細胞的生命活動和產生任何物理化學變化以致細胞死亡的一種染色方法［1］。活性染色按染色途徑和方法可分為體外活性染色和體內活性染色，用健那綠染色線粒體屬于體外染色，以臺盼藍或者墨汁注入動物腹腔研究吞噬細胞則屬于體內染色。

對細胞、 細胞器或其他物質染色的目的是為了對所染色對象進行結構和代謝方面的觀察。在眾多的染料中，高中生物學所涉及的活性染料有3 種，分別是健那綠、亞甲基藍和臺盼藍，目前高中生物學教學中對健那綠染料的實驗過程分析較深入，但對健那綠如何進入細胞染色出現較多的爭議，現從活性染料健那綠的化學本質、 染色機理、運輸方式及試劑配制4 個方面進行綜合分析。

1 化學本質

1.1 化學結構 健那綠，別稱詹納斯綠、 鐵蘇木精，分子式C30H31ClN6，為具有吩嗪結構的堿性染料。吩嗪結構具有難溶于水、微溶于乙醇等有機物質，固態成針狀晶體，顏色為近乎無色等特征。從結構式分析，健那綠中含有4 種基本基團，分別為二甲基胺 （氫原子被取代后認為含叔胺）、 二乙基胺（氫原子被取代后認為含叔胺）、 苯環和吩嗪結構（含仲胺、季胺）（圖1）。從整體結構上看，由于該結構屬于氯化物的鹽類，因此可溶于水，但水解后產生的陽離子基團因攜帶3 種結構而呈現不同的溶解性質，所以該物質最終表現的化學性質為溶于水還是溶于有機溶劑時必須將其一分為二進行分析。

圖1 3 種N 中心原子的化學結構

1.2 化學性質

1.2.1 吩嗪結構的化學性質 在化學上，吩嗪及其衍生物是重要的精細化工的原料，在人類的生產生活中具有廣泛的應用［2］，例如目前很多菌種分泌的吩嗪結構物質可以作為有效的殺菌藥物。

從吩嗪結構基團的極性角度看，吩嗪結構為典型的呈正六邊形的非極性結構；從陽離子基團的極性角度看，由于健那綠左右兩側的結構基團不一致，其電荷中心不能重合，因此整個陽離子基團是極性結構。從化學“相似相容”的一般原理分析，極性分子應與極性分子互相溶解，非極性分子應與非極性分子溶解，可以知道，水解后的健那綠的陽離子基團可溶于水而微溶于有機溶劑。但在某些情況下，分子的溶解性并不僅僅取決于其極性及極性的大小，應更多地看其分子結構是否相似。

吩嗪結構為具有3 個環狀結構的有機物，不具備羥基，其結構與水的結構完全不同，因此，雖然兩者都有極性，但在溶解度上卻是不相溶的，或者說吩嗪結構在水中的溶解度極低，即難溶于水。

1.2.2 有機胺結構的化學性質 有機胺種類多樣、結構多種，具有較為極端的生理性質，如致癌等。健那綠陽離子基團中的有機胺分別為二甲基胺（1）、二乙基胺（2）、仲胺（3）、季胺（4）4 種，具體結構如圖所示：

圖2 4 種有機胺

在有機化學中，伯、仲、叔胺都能與水分子形成氫鍵，因此低級胺易溶于水，胺的溶解度隨分子量的增加而迅速降低，從6 個碳原子的胺開始就難溶于水，而一般可溶于醇、苯等有機溶劑［3］。從健那綠的拆分結構看，除了季胺不易溶于水外，其余3 個有機胺均可溶于水；從整體分子結構看，其碳原子的總數遠遠多于6 個，不易溶于水。

1.2.3 甲基的化學性質 在藥物化學中，甲基的應用非常廣泛，可用于合成特殊性質的有機物。有研究表明，在藥物分子中引進甲基，能夠增加化合物的脂溶性，進而提高透過生物膜的能力［4］。在健那綠分子中，具有多個甲基基團，在一定程度上增加了其脂溶性。

綜上所述，對健那綠分子的陽離子基團而言，其溶于水的能力較弱，而可以溶于有機溶劑。

2 染色機理

2.1 基本原理 健那綠是對線粒體具有專一性染色且毒性最少的一種堿性染料，其基本原理是由于線粒體中細胞色素氧化酶系的作用，使染料始終保持氧化狀態而保持藍綠色，而細胞質則被還原為無色。因此，健那綠不僅可以用于進行線粒體的觀察，也可以用于區分活細胞與死細胞，例如細菌細胞膜上有氧化酶，所以細菌也可以被健那綠B 染成藍綠色［5］。當然，雖然健那綠是活性染料，但是對染色時間也是有要求的。有研究表明，人口腔上皮細胞一般染色20 min 左右，時間稍長或稍短沒有明顯影響［6］，但時間過長（約1 h）后，細胞會死亡而影響實驗的觀察。

2.2 線粒體的染色原因 從前面的原理分析中得知，健那綠能夠染色線粒體的主要原因在于線粒體膜具有氧化酶，能夠使甲基綠保持氧化狀態而呈現藍綠色。但問題的關鍵在于為什么染料能夠進入線粒體而不在于為什么呈現藍綠色。

解決這個問題的關鍵在于要了解染料的電化學的特性。從上述分析中得知，健那綠水解后帶有顏色的部分是陽離子基團而不是陰離子（Cl-），陽離子基團更容易和陰離子基團結合。

第1，線粒體膜具有氧化酶系。由于質子泵的存在，使得線粒體膜間隙聚集了大量的陽離子，即呈現正電荷，而線粒體基質則由于聚集了大量的陰離子，即呈現負電荷。因此，線粒體基質可以有效吸引呈現正電荷的健那綠陽離子基團。第2，有研究表明，線粒體外膜通透性較高，允許分子量在15 kD 以下的分子通過，而內部則不允許分子量大于1.5 kD 的分子通過［7］，因此，分子量為511Da的健那綠可以通過外膜和內膜進入線粒體基質。第3，在線粒體的內、外膜之間還存在著“孔蛋白”的離子通道或離子轉運體［8］，也有可能對健那綠物質的運輸具有輔助作用。綜上所述，在陰、陽離子的相互吸引及可能的孔蛋白的幫助下，健那綠的陽離子基團可以進入線粒體被氧化而呈現藍綠色。

3 健那綠進入細胞的運輸方式

3.1 健那綠進入細胞的運輸方式的問題 在染色過程中，健那綠可以進入細胞中的線粒體，使得線粒體著色成藍綠色。有教師認為，健那綠進入細胞中的運輸方式為胞吞或者主動運輸，原因在于實驗過程中需要用到生理鹽水，所以其可溶于水，因而是親水性而非脂溶性的物質；也有教師認為，健那綠進入細胞的運輸方式為自由擴散，原因在于其結構中具有吩嗪結構，因此是脂溶性的，可以通過自由擴散進入細胞中。

3.2 健那綠進入細胞的運輸方式的分析 上述2 種觀點的爭論在于沒有了解健那綠的化學結構及其性質導致的。從前面關于健那綠的結構和形式的描述中得知，在溶于水的主要原因在于健那綠是氯化物的鹽類，其水解后的陽離子基團很難溶于水。

在了解上述問題的基礎上，對甲基綠進入細胞的方式進行分析。從生理學角度講，甲基綠相較于細胞來說是外界物質，且其具有一定的毒性（活性染料一般是經稀釋后低毒或無毒，并不是本身就低毒或無毒），因此細胞不能主動吸收該物質，即不會通過胞吞或主動運輸吸收； 從化學結構和性質角度講，甲基綠水解后的陽離子具有脂溶性，可以擴散通過細胞膜。因此，陽離子進入細胞中的方式是自由擴散。

所以，進入細胞中的結構應該是健那綠水解后的陽離子基團而非健那綠的整個結構，且陽離子脂溶性使得可以通過擴散的方式進入細胞。

3.3 “箭頭模型”假說 “箭頭模型”假說形象化了健那綠的分子結構，更為直觀的闡述其通過膜的方式。該模型中，以吩嗪結構作為“箭頭”，以“二甲基胺和二乙基胺”作為“兩翼”，共同構成完整的“箭頭模型”，具體模型如圖3所示。

圖3 健那綠運輸的“箭頭模型”

吩嗪結構的脂溶性下，陽離子自由擴散通過膜結構，其兩翼的二甲基胺和二乙基胺逐次依次通過，剩下的苯環結構最終通過膜。

4 配制健那綠溶液時的問題

1）為什么要加入生理鹽水而不是蒸餾水或純凈水。

生理鹽水，即與人體內環境濃度基本相當的無菌鹽水，其基本作用在于維持細胞滲透壓，防止發生吸水漲破。在實驗中，一般所使用的材料為人口腔上皮細胞的線粒體，因此用生理鹽水有助于保持細胞的活性。一般而言，在實驗操作中的線粒體的活性保持時間約為1 h。

如果在實驗操作時加入蒸餾水或純凈水，雖然后續制片過程中也有生理鹽水，但因在添加染料時會重復多次操作，很明顯，這樣操作會降低生理鹽水的濃度，有可能使細胞吸水漲破，所以不能加入蒸餾水或純凈水。

2）為什么不將健那綠溶解到有機溶劑再進行染色。

第1，由于大多數的有機溶劑是有毒的，對細胞具有毒害作用，容易通過自由擴散進入細胞內導致毒害的發生，而且即使沒有毒害的發生，也會和脂溶性的健那綠發生類似于群落中的“種間競爭”關系而導致染色效果不好，因此實驗時要盡可能不用有機溶劑。

第2，在健那綠的單質中，需要的是經過解離后的陽離子基團，而非整個健那綠單質，因為如果是健那綠的單質，則不能通過陰陽離子的結合附著在線粒體膜上（前面已經敘述），因此，需要用水進行解離獲得陽離子基團。

3）為什么要加熱。健那綠要溶解在生理鹽水中使用，而實際操作中，它的溶解度并不大，溶解速度也非常緩慢，所以要對溶液加熱使得健那綠燃料能夠快速、充分地溶解在生理鹽水中。溫度超過50℃，健那綠就可能發生水解導致不能染色，所以推薦加熱溫度30～40℃。這同時也是大多數生物的體溫。使用30～40℃的染料對活細胞進行染色，也有助于提高細胞代謝水平，加快染色進度。加熱的步驟事實上也驗證了前面所說的健那綠的水解與脂溶性的問題。

5 其他問題

在藥代動力學中，還有分子極性表面積與藥物吸收之間的關系。通過分析有機分子的極性表面積可以預測該物質能否通過細胞膜及通過細胞膜與物質濃度之間的線性或者非線性的關系，也不失為探討本文問題的方法之一。