三葉木通微衛星分子標記開發及評價

李同建 董婧 廖亮 金洪光 韓興杰 文鋒 徐玲玲

摘 要： 為了獲得適于三葉木通遺傳多樣性和遺傳結構研究的微衛星分子標記，該研究采用磁珠富集法構建了三葉木通微衛星富集文庫。結果表明：在150個陽性克隆中發現了70個微衛星位點，富集效率為46.67%，其中含雙堿基重復單元的序列占比為79.37%，三堿基和四堿基重復含有量較少。共設計引物63對，其中篩選出16對高多態引物，對1個三葉木通自然居群48個個體進行了遺傳分析，結果顯示位點的等位基因數為10～22個，觀察雜合度和期望雜合度分別為0.370～0.792和0.724～0.936，多態性信息指數為0.725～0.919，表明以上引物均為高多態性引物。其中，12個位點偏離哈迪-溫伯格平衡，呈現出純合子過剩狀態，這可能與啞等位基因和其它因素有關。綜上結果表明，該研究所開發的16對引物能夠用于三葉木通遺傳多樣性和遺傳結構評價工作。

關鍵詞： 三葉木通， 微衛星分子標記， 磁珠富集法

中圖分類號： Q943.2， Q75 文獻標識碼： A 文章編號： 1000-3142（2018）09-1117-08

Abstract： Akebia trifoliata is perennial， woody vine producing large edible fruits. The high medicinal and nutritional values of A. trifoliata make it worthy of being exploited as a new crop. Wild resources of these species have been se-riously deteriorated due to years of disorder planting and over-harvesting， thus wild germplasm resources protection and evaluation are particularly important. In order to obtain suitable molecular markers for genetic structure and genetic diversity of the existing resources， enriched SSR library was established using the magnetic bead enrichment procedure. Seventy SSR loci were obtained in 150 positive clones， and enrichment efficiency was 46.67%. Thereinto， sequences with two-base repeat unit accounted for 79.37%， far more than sequences with three-base and four-base. Sixteen pairs of high polymorphic primers were chosen in sixty-three pairs primers and characterized by 48 individuals collected in Lushan. The allele numbers per locus ranged from 10 to 22， and the observed and expected heterozygosity ranged from 0.370 to 0.792 and from 0.724 to 0.936， respectively， polymorphisms information content ranged from 0.725 to 0.919， which showed that the above primers were high polymorphic primers. Twelve pairs of primers deviated from Hardy-Weinberg equilibrium， showing excess of homozygotes， which might be related to null genes and other reasons. These molecular markers will contribute to evaluation on genetic diversity and population structure， lay a foundation for conservation and evaluation of A. trifoliata genetic resource.

Key words： Akebia trifoliata， microsatellite marker， magnetic bead enrichment

三葉木通（Akebia trifoliata）是木通科（Lardizabalaceae）木通屬（Akebia Decne.）的一種半落葉木質藤本纏繞植物，分布于秦嶺以南至南嶺，西至云南，東至浙閩16個省廣大亞熱帶地區（萬明長等， 2008）。其種下劃分為三葉木通（A. trifoliata subsp. trifoliata）、白木通（A. trifoliata subsp. australis）、長萼三葉木通（A. trifoliata subsp. longisepala） 3亞種（中國植物志編輯委員會， 2001）。木通屬植物具有利尿、鎮痛、祛風濕的功效，作為中藥有兩千多年的歷史（馮航， 2010； 李麗等， 2010； 李麗， 2010）。近期研究表明，其還具有抗衰老、提高免疫功能、抑制腫瘤等功效（An et al， 2016）。木通屬植物果實較大，果肉甜糯，具有極高開發價值，在湖南、江西、貴州等地已有農戶開始種植（羅克明等， 2008）。其種子含油量達40%，具有較高的食用價值（仲偉敏和馬玉華， 2016）。與其高開發價值不匹配的是三葉木通種質資源研究較晚，大規模無序的種植、開發對野生種質資源造成巨大威脅。因此，有必要深入研究三葉木通種質資源，利用現代育種技術培育栽培品種，為三葉木通資源的可持續利用和種植產業起步打下基礎。九江學院在中國、日本和韓國已搜集70余個不同產地的野生三葉木通資源，建設了三葉木通種質資源圃。但是，由于三葉木通分子生物學研究起步較晚，GenBank中僅能檢索到440余條DNA序列，可用的分子標記較少，嚴重阻礙了資源的評價工作，因此急需開發合適的分子標記對現有資源進行遺傳結構和遺傳多樣性評價（Li et al， 2009； Sun et al， 2016； 黃佩蓓等， 2016）。

微衛星分子標記具有多態性高、共顯性、重復性好、條帶少易識別等諸多優點，是目前遺傳多樣性和遺傳結構研究中的首選標記之一（Grover & Sharma， 2016），隨著熒光毛細管電泳技術在微衛星檢測中的應用，微衛星標記變得更加高效和廉價（Wenz et al， 1998）。本研究擬采用 三葉木通微衛星分子標記，并利用7個不同產地的三葉木通個體和1個三葉木通自然居群檢測引物的穩定性和多態性，以期獲得適于三葉木通遺傳多樣性和遺傳結構研究的微衛星分子標記。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料采集 在人工種植基地采集栽培三葉木通個體7個，用于檢測微衛星引物擴增穩定性和多態性。在九江廬山采集三葉木通自然居群1個（n=48），用于微衛星文庫建立和后期引物評價（表1）。采集每個個體新鮮、健康的幼嫩葉片放入裝有變色硅膠的自封袋中迅速干燥，置于-20 ℃低溫冰箱中保存備用。憑證標本保存于九江學院藥學與生命科學學院分子生物學研究室。

1.1.2 試劑 10×PCR buffer、25 mmol·L-1 MgCl2、dNTPs、DNA Taq聚合酶（5 U·μL-1）均購自上海生工生物（Sangon Biology）工程有限公司；限制性內切酶Rsa I（10 U·μL-1）、BstU I（10 U·μL-1）、Xmn I（20 U·μL-1）購自New England Biolabs公司；T4 DNA Ligase（400 U·μL-1）購自Promega公司； DNA Marker購自大連Takara公司； 接頭引物SuperSNX24-F （5′-GTTTAAGGCCTAGCTAGCAGCAGAATC）和Super-SNX24-R （5′-GATTCTGCTAGCTAGGCCTTAAACAAAA）由上海英俊生物技術有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取 已干燥的三葉木通樣本采用改良的CTAB法提取總DNA（Doyle & Doyle， 1987），并利用PEG8000純化，詳細步驟為將40% PEG8000與5 mol·L-1 NaCl按1∶1比例配置成工作液，與等比例的DNA溶液混合，搖勻并置于37 ℃下靜置15 min，12 000 r·min-1離心16 min，沉淀再由80%乙醇清洗2次，烘干。TE溶解后用Nanodrop檢測合格后，置于-20 ℃冰箱備用。

1.2.2 酶切與接頭連接 使用限制性內切酶Rsa I或BstU I和Xmn I組合對三葉木通基因組DNA進行酶切，于37 ℃溫浴過夜。酶切體系為25 μL：2.5 μL 10×T4 ligase buffer（NEB4），0.25 μL 100×BSA，0.25 μL 5 mol·L-1 NaCl，1.0 μL 10 U·μL-1 Rsa I/BstU I，1.0 μL 20 U·μL-1 Xmn I，20 μL 200 ng·μL-1 DNA。取1 μL酶切產物先用1%瓊脂糖膠電泳檢測酶切片段是否位于200～800 bp范圍內；然后將SuperSNX24-F和SuperSNX24-R合成接頭置于水浴鍋中95 ℃反應5 min，緩慢冷卻至室溫；最后將制備好的接頭與酶切產物連接。反應體系如下：7 μL接頭，2.5 μL NEB 10×T4 ligase buffer，2.0 μL 350 U·μL-1 T4 ligase，13 μL酶切產物，加雙蒸水至25 μL，16 ℃連接過夜。將連接產物作為模板，利用SuperSNX24-F接頭作為引物通過PCR擴增檢測連接結果。反應體系如下：2.5 μL 10×PCR buffer，0.13 μL 100 μmol·L-1 SuperSNX24-F，1.5 μL 2 mmol·L-1 dNTP，2.0 μL 25 mmol·L-1 MgCl2，2.5 μL BSA，0.2 μL 連接產物DNA，加雙蒸水至25 μL。PCR反應程序：95 ℃預變性2 min；95 ℃變性20 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸1.5 min，循環24次；72 ℃延伸10 min。

1.2.3 雜交與磁珠富集 微衛星富集采用Glenn & Schable（2005）的方法，將連接產物與帶生物素的探針混合物（AG）12、（CG）12、（AT）12、（GT）12、（ACT）12、（AAGT）8、（AACT）8、（AGAT）8進行雜交。雜交反應體系：25 μL 2×Hyb Solution，10 μL 10 μmol·L-1生物素標記的探針，10 μL連接產物，加雙蒸水至50 μL。雜交反應程序：95 ℃預變性5 min；70 ℃開始，每個循環降低0.2 ℃，維持5 s，循環99次；50 ℃保持5 min；每個循環降低0.5 ℃，保持5 s，循環20次；15 ℃保持。用鏈霉素親和磁珠（Promega Magne Sphere）捕獲結合了生物素探針的DNA片段，用洗脫液洗脫未結合的探針。具體操作如下：250 μL TE 洗滌50 μL混勻的磁珠2次，50 μL 1×Hyb Solution平衡磁珠2次；將DNA和生物素探針混合物的雜交體系加入到磁珠中，于16 ℃下150 r·min-1振蕩約1 h雜交；加入400 μL Wash Solution I洗脫2次，且第一次加入400 μL Wash Solution Ⅱ于45～48 ℃下水浴振蕩2 min洗脫2次，再次加入400 μL Wash Solution Ⅱ混勻，于50～53 ℃下水浴振蕩2 min洗脫2次。加入200 μL TE于95 ℃下水浴5 min徹底洗脫富集DNA，向上清液中加入22 μL 3 mol·L-1醋酸鈉和445 μL預冷的無水乙醇，沉淀DNA。用80%乙醇洗滌，離心烘干后加入20 μL TE溶解。用接頭SuperSNX24-F作為引物對富集產物進行PCR擴增回收，PCR反應體系和程序與檢測時相同。為增加富集的陽性率，重復以上步驟1次，進行2次富集，用PEG8000法純化DNA。

1.2.4 克隆與陽性篩選 將純化后的富集產物克隆到pEGM-T載體中，連接反應在PCR儀上16 ℃過夜，將重組子轉入大腸桿菌感受態細胞中培養24 h。每板挑取50～100個白色單菌落，在另一含Amp的LB固體培養基平板上劃線，并接種于菌落PCR反應液中，通過菌落PCR（M13F和M13R為引物）篩選出陽性克隆，把劃線的平板置于37 ℃培養箱中培養過夜。取3 μL擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其是否為含有目的片段的陽性菌落。選擇PCR檢測為陽性的菌落接種至500 μL含Amp的LB液體培養基中，于37 ℃下200 r·min-1振蕩培養過夜，將培養菌液送往上海生工生物工程技術有限公司測序。

1.2.5 序列分析與引物設計 首先，將測序結果導入Geneious 4.8軟件中進行檢測，使用Trim-ends和Search for the motifs工具去除載體和接頭序列，對有疊峰的序列進行反向測序。然后，將經過處理的序列通過Tandem Repeats Finder version 4確定SSR位點，并分析位點的堿基重復序列和重復次數、查看序列長度及微衛星位點兩端側翼序列是否符合引物設計的要求（Benson， 1999）。使用Geneious 4.8內嵌的引物設計功能進行引物設計。所設計引物送于上海生工生物工程有限責任公司合成。

1.2.6 引物穩定性、多態性篩選及評價 為了篩選擴增穩定性好、多態性高的引物和其最佳PCR條件，我們用設計的引物對7個不同地區采集的三葉木通進行PCR擴增，PCR產物經8%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。

將篩選出的高多態性SSR引物合成5′端熒光標記引物，其熒光基團為FAM（藍色），HEX（綠色）。選取采集于九江廬山的48個樣本進行PCR擴增，送往北京閱微基因有限公司使用ABI3730遺傳分析儀進行STR分型，內標均為ROX500。

1.2.7 數據分析 首先，使用Genemapper 4.1軟件進行數據統計，通過Micro-Checker 2.2.3檢測啞等位基因（Van Oosterhout et al， 2004）。然后，用Genalex 6.5（Peakall & Smouse， 2010） 計算出每個位點的等位基因數（Na）、 有效等位基因數 （effective number of alleles，Ne）、觀察雜合度（observed heterozygosity，Ho）、期望雜合度（expected heterozygosity，He）及哈迪-溫伯格平衡（Hardy-Weinberg equilibrium，HWE）。最后，使用PowerMaker （Liu & Muse， 2005）計算多態性信息指數（polymorphic information content，PIC）和連鎖遺傳不平衡（linkage disequilibrium， LD）。所有P值均經Bonferroni法校正。

2 結果與分析

2.1 微衛星富集

選擇2個限制性內切酶組合（Rsa I和Xmn I、BstU I和Xmn I）對三葉木通基因組進行酶切，Rsa I和Xmn I的組合酶切后基因組小片段電泳條帶彌散，大小分布在100～1 500 bp之間，為后續實驗的連接和雜交富集打好基礎。BstU I和Xmn I的組合酶切片段較長，片段長度集中在100～200 bp、300～500 bp及大于1 500 bp，這些酶切產物不利于后續磁珠富集操作。本研究用金屬浴加熱進行漂洗，先在16 ℃下用Washing Solution I漂洗1次；再用Washing Solution Ⅱ分別在45 ℃和50 ℃下漂洗2次，結果富集率太低。然后調整漂洗溫度，用Washing Solution Ⅱ分別在46 ℃和51 ℃下漂洗2次，獲得所需目的片段，且大大提高了陽性克隆率。

共挑取230個陽性克隆進行PCR檢測，大小在300～1 000 bp之間，其中約有40個未擴增出目的片段，部分菌落空載。在190個陽性克隆中挑選出片段長度不同的150個單菌落送往公司測序，148個測序成功。其中，70個含有微衛星序列，富集率為46.67%；可設計引物的序列有57條，占SSR序列的81.43%。57條可設計引物的序列共設計引物63對，其中含雙堿基重復單元的序列占SSR序列的79.37%，高于三堿基重復單元的序列占SSR序列的20.63%。

2.2 引物篩選與分析

54對引物擴增產物大小在100～300 bp之間。先用7個DNA樣本為模板初次篩選出條帶清晰、有多態性的引物33對；再用48個DNA樣本為模板進一步對33對引物進行篩選，選出條帶清晰、非特異性條帶少、多態性較高及擴增效率穩定的引物16對，可以用于SSR位點分析。

48個樣品的三葉木通居群中共檢測到220個等位基因，每個位點的等位基因數為10～22個，平均等位基因數為15.938個，觀察雜合度為0.370～0.792，期望雜合度為0.724～0.936，多態性信息指數為0.725～0.919（均值為0.861），其中12個位點經Bonferroni校正后仍然偏離哈迪-溫伯格平衡，呈現純合子過剩狀態，檢測到14個位點存在大小不等的啞等位基因頻率。發現了3個引物對（MT33-MT45，MT15-MT56和MT35-MT62）存在連鎖不平衡（表2）。

3 討論與結論

隨著高通量測序技術的發展，使得SSR位點獲得更加低廉、高效，越來越多的研究利用簡化基因組測序和轉錄組測序技術進行高效的微衛星開發（萬冬梅等，2016）。在群體遺傳和進化研究中需要的微衛星位點數量較少，磁珠富集法可在1周內完成微衛星富集文庫構建工作，其高效、快捷的特點更適合少量微衛星引物的開發（王靜等， 2015）。在本研究中，因實驗室熟練掌握了磁珠富集法，故選用該方法構建三葉木通的微衛星富集文庫，在148個成功測序的陽性克隆中獲得70個富含微衛星的序列，富集效率較高，達到46.67%。雖然本研究使用了8種不同的探針，包括雙堿基重復、三堿基重復和四堿基重復，但富集的微衛星序列主要以雙堿基重復為主（79.37%），三堿基和四堿基重復含有量較少。開發的16對引物中僅有2對引物為三堿基重復（MT27，MT33）。這與前人報道的植物中微衛星序列主要以雙堿基重復為主一致（Morgante & Olivieri， 1993）。

利用篩選到的16對引物對采自廬山的三葉木通居群進行遺傳分析，共擴增出220個多態性條帶，發現以上引物的平均等位基因數為15.938個，觀察雜合度為0.370～0.792，期望雜合度為0.724～0.936，這與李麗（2010）的研究結果相近。多態性信息指數（PIC）是評估微衛星引物多態性水平的重要參數，普遍認為PIC>0.5為高多態引物，0.25綜上所述，本研究開發的16對SSR多態性引物可用于三葉木通遺傳分析，進一步補充和完善了木通微衛星分子標記工具，為三葉木通種質資源評價和開發等后續研究打下了堅實基礎。

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