瑤藥破骨風的水提工藝優化及其水提物的抗炎鎮痛作用研究

黃健軍 岑芳 鄧剛

中圖分類號 R284.2；R285.5 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）08-1052-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.08.10

摘 要 目的：優化瑤藥破骨風的水提取工藝，并考察其水提物的抗炎鎮痛作用。方法：采用單因素試驗和正交試驗，以阿魏酸含量、干膏率為指標，考察提取時間、液料比、提取次數3個因素對水提取工藝的影響，優選最佳工藝，并進行驗證試驗。以阿司匹林為陽性對照，采用二甲苯致小鼠耳廓腫脹法和角叉菜膠致小鼠足腫脹法觀察低、中、高劑量（3、6、12 g/kg，以生藥計）的破骨風水提物的抗炎作用，采用熱板致小鼠疼痛反應和醋酸致小鼠扭體反應考察其鎮痛作用；采用酶聯免疫吸附法（ELISA）測定小鼠以角叉菜膠致炎后血清中腫瘤壞死因子α（TNF-α）和白細胞介素1β（IL-1β）的含量，采用紫外分光光度法檢測小鼠血清和炎性組織中前列腺素E2（PGE2）的含量。結果：最優提取工藝為提取時間120 min，液料比16 ∶ 1（mL/g），提取3次。與模型組比較，破骨風水提物低、中、高劑量組小鼠耳廓腫脹度、足腫脹率均顯著降低，扭體次數顯著減少，疼痛反應痛閾值顯著升高（P<0.05或P<0.01）；與模型組比較，該水提物低、中、高劑量組小鼠血清中的TNF-α、IL-1β、PGE2含量與炎性組織中的PGE2含量均顯著減少（P<0.05或P<0.01）。結論：優選的瑤藥破骨風水提工藝效率高、穩定可行；其水提物對模型小鼠具有明顯的抗炎鎮痛作用，可能是通過降低體內TNF-α、IL-1β、PGE2水平發揮作用。

關鍵詞 瑤藥；破骨風；水提取；工藝優化；抗炎；鎮痛

ABSTRACT OBJECTIVE： To optimize the water-extraction technology of Yao medicine Jasminum lanceolarium and study the anti-inflammatory and analgesic effect of its water extract. METHODS： The single factor test and orthogonal test were used to investigate the effects of extraction time， liquid-solid ratio and extraction times on water-extraction technology and optimize extraction technology using ferulic acid content and dry extract yield as index. The validation test was also conducted. With aspirin as positive control， the method of ear edema induced by xylene and paw edema induced by carrageenan in mice were used to observe the anti-inflammation effects of low-dose， medium-dose and high-dose （3， 6， 12 g/kg， by crude drug） of J. lanceolarium water extract； the analgesic effect of those was investigated by hot-plate induced pain response test and mice writhing response test. The contents of TNF-α and IL-1β were determined by ELISA after carrageenan induced inflammation in mice. The contents of PGE2 in serum and inflammation tissue were detected by UV spectrophotometry. RESULTS： The optimal extraction technology was as follows as extraction time of 120 min， liquid-solid ratio of 16 ∶ 1 （mL/g）， extracting for 3 times. Compared to model group， the ear edema degree and paw edema rate of mice were raduced， writhing response times were lessened， and pain response threshold was enhanced significantly in low-dose， medium-dose and high-dose groups of J. lanceolarium water extract （P<0.05 or P<0.01）. Compared to model group， the contents of TNF-α， IL-1β and PGE2 in serum and the content of PGE2 in inflammation tissue of mice were raduced significantly in low-dose， medium-dose and high-dose groups of J. lanceolarium water extract （P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS： The optimized water-extraction technology of Yao medicine J. lanceolarium shows high efficiency， stable and feasible. Water extract shows significant anti-inflammatory and analgesic effects through reducing the contents of TNF-α， IL-1β and PGE2.

KEYWORDS Yao medicine； Jasminum lanceolarium； Water extraction； Technology optimization； Anti-in?ammation； Analgesic

瑤藥破骨風為木犀科植物清香藤（Jasminum lanceolarium Roxb.）的全草，作為104種經典瑤藥之一，其味苦、辛，性平，可祛風除濕、活血散瘀、消腫止痛；主治“崩閉悶”（風濕痛、類風濕性關節炎）、“改布悶”（腰腿痛）、“播沖”（跌打損傷）、“眸名腫毒”（無名腫毒）及“不錐累”（瘡癤癰腫）等[1]。破骨風收載于《廣西瑤族習用藥材質量標準》（第一卷），瑤語發音為“排迸崩”，別名清香藤，在廣西、廣東、云南、貴州等地均有分布[2]。破骨風主要含有環烯醚萜、木脂素、黃酮、三萜、簡單苯丙素等成分[3-5]。阿魏酸是破骨風中的主要活性成分之一，具有抗氧化和清除自由基[6]、抗血栓[7]、降血壓和抗癌[8]等作用，目前常用高效液相色譜法（HPLC）測定其含量。破骨風在廣西尤其是瑤族地區植物資源豐富、民間藥用歷史悠久[3-4]，但是關于其現代醫藥學研究的報道較少，極大地制約了該藥材的開發利用。將民間習用藥材制成中藥顆粒劑，具有用量小、起效快、質量可控、攜帶方便等優點[9]。為充分發揮破骨風資源和療效的優勢，本研究根據前期預實驗結果，以阿魏酸含量和干膏率為指標，采用單因素試驗和正交試驗優選破骨風的水提工藝；在此基礎上考察其水提物對模型小鼠的抗炎鎮痛作用并初步探討其作用機制，為相關制劑的后續研發提供實驗依據。

1 材料

1.1 儀器

LC-10A型HPLC儀，包括UV-10A紫外檢測器、威瑪龍色譜工作站（日本Shimadzu公司）；XS205DU型電子分析天平（梅特勒-托利多國際貿易上海有限公司）；752型紫外分光光度計（上海舜宇恒平科學儀器有限公司）；DK-S24型數顯恒溫水浴鍋（上海精宏實驗設備有限公司）；TDL80-2B型離心機（上海安亭科學儀器廠）；RE-52AA型旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）；RB-200型智能熱板儀（成都泰盟科技有限公司）。

1.2 藥品與試劑

阿魏酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：120927-201110，供含量測定用）；阿司匹林片（湖南新匯制藥有限公司，批號：160805，規格：50 mg/片）；生理氯化鈉溶液（四川科倫藥業股份有限公司，批號：A17042508-2，規格：500 mL ∶ 4.5 g）；角叉菜膠（美國Sigma公司，批號：088K0317）；冰醋酸（成都市科龍化工試劑廠產品，批號：20140716）；人白細胞介素1β（IL-1β）酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（批號：E-EL-M0037c）和腫瘤壞死因子α（TNF-α）ELISA試劑盒（批號：E-EL- M0049c）均由武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司提供；甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純，水為純化水。

1.3 藥材

破骨風藥材于2015年8月采自廣西壯族自治區金秀瑤族自治縣，經廣西健豐藥業有限公司粱可文副研究員鑒定為木犀科植物清香藤（J. lanceolarium Roxb.）的全草。

1.4 動物

昆明種小鼠，雌雄各半，體質量為（20±2）g，購自桂林醫學院實驗動物中心，使用許可證號：SCXK（桂）2007-0003。

2 方法與結果

2.1 阿魏酸的含量測定方法

2.1.1 色譜條件與系統適用性、專屬性試驗 色譜柱：Aichrom C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-0.085%磷酸（15 ∶ 85，V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：316 nm；柱溫：35 ℃；進樣量：10 μL。在此條件下，理論板數按阿魏酸峰計均在5 000以上；藥材中其他成分對阿魏酸的測定無干擾，專屬性良好。色譜見圖1。

2.1.2 溶液的制備 （1）對照品溶液。精密稱取阿魏酸對照品適量，置于棕色量瓶中，以70%甲醇溶解制成56.5 μg/mL的溶液，即得。（2）供試品溶液。將藥材樣品粉碎，過2號篩（下同），精密稱取適量，置于棕色錐形瓶中，加水，稱定質量后回流提取；放冷，再次稱定質量，用水補足減失的質量，搖勻，經0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.1.3 方法學考察 （1）線性關系考察。精密吸取“2.1.2”項下對照品溶液3、6、9、12、15 μL，按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，以進樣量（x，μg）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程y=2 413 310.9x+ 48 890.4（r=0.999 5），結果表明阿魏酸檢測進樣量線性范圍為0.169 5～0.847 5 μg。（2）精密度試驗。分別精密吸取“2.1.2”項下對照品溶液和供試品溶液各10 μL，按“2.1.1”項下色譜條件連續進樣6次，結果對照品溶液和供試品溶液峰面積的RSD分別為0.82%、0.93%。（3）穩定性試驗。將“2.1.2”項下對照品溶液和供試品溶液于室溫避光放置24 h，分別于0、2、4、8、12、24 h時按“2.1.1”項下色譜條件進樣10 μL，結果對照品溶液和供試品溶液峰面積的RSD分別為1.15%、1.20%。（4）加樣回收率試驗。取已知含量的藥材樣品適量，共6份，分別精密加入對照品溶液適量，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1.1”項下色譜條件測定阿魏酸含量并計算加樣回收率，結果平均加樣回收率為99.25%，RSD為1.20%。

2.2 干膏率測定方法

精密吸取“2.3”提取工藝項下的提取液20 mL，置于干燥至恒質量的蒸發皿中，按照2015年版《中國藥典》（四部）“通則0831干燥失重測定法”[10]測定并計算干膏率。干膏率（%）=干膏質量（g）/藥材質量（g）×100%。

2.3 破骨風水提工藝的優選

2.3.1 單因素試驗 對影響提取工藝的主要因素（提取時間、液料比、提取次數）進行單因素考察。（1）提取時間：精密稱取適量藥材樣品粉末5份，各加入25倍量水，分別回流提取30、60、90、120、150 min；（2）液料比：精密稱取適量藥材樣品粉末5份，分別加入8、12、16、20、24倍量水，回流提取90 min；（3）提取次數：精密稱取適量藥材樣品粉末5份，加入20倍量水，分別回流提取1、2、3、4、5次，每次120 min。按“2.1”“2.2”項下方法分別測定各條件下所得水提物的阿魏酸含量和干膏率。結果顯示，提取時間在60～120 min、液料比在12 ∶ 1～20 ∶ 1、提取1～3次的條件下，阿魏酸和干膏率的提取效果較好，故在此條件范圍內進行正交試驗優化。

2.3.2 正交試驗 根據單因素試驗結果，選擇提取時間（A）、液料比（B）、提取次數（C）為主要影響因素，按L9（34）正交表設計試驗，每個試驗條件下平行試驗3次，依法測定水提物的阿魏酸含量和干膏率。因素與水平見表1，正交試驗設計與結果見表2，方差分析結果見表3。

由表2結果可知，A、B、C 3個因素對破骨風提取效率的影響大小順序依次為C>A>B；由表3結果可知，C因素（提取次數）對阿魏酸量和干膏率的影響均有統計學意義，A3B1C3工藝結果最佳。但由于B因素影響程度最小，出于節約成本等多方面綜合考慮，選擇最優工藝為A3B2C3，即提取時間為120 min，液料比16 ∶ 1，提取3次。

2.3.3 驗證試驗 取藥材樣品粉末3份，按“2.3.2”項下優選工藝提取并測定。結果顯示，阿魏酸含量分別為1.56、1.54、1.56 mg/g（RSD=0.61%，n=3），干膏率分別為18.36%、18.22%、18.17%（RSD=0.44%，n=3），結果穩定，且均高于正交試驗結果，因此確定A3B2C3為最優水提工藝。

2.4 破骨風水提物抗炎鎮痛作用研究

考察破骨風水提物對模型小鼠的抗炎鎮痛作用。計量資料均以x±s表示，采用SPSS 13.5統計軟件進行統計學分析。P<0.05表示差異有統計學意義。

2.4.1 破骨風水提物給藥液的制備 取藥材樣品粉末，按“2.3”項下優選工藝提取后，濃縮成浸膏，用0.5%羧甲基纖維素鈉溶液定容至100 mL（1 g/mL，以生藥計），于4 ℃保存備用。本實驗中給藥劑量（g/kg）均按給藥液中所含生藥的質量計算。

2.4.2 二甲苯致小鼠耳廓腫脹實驗 參照文獻[11]方法，取小鼠50只，雌雄各半，按數字隨機表分為模型組（等量生理鹽水）、陽性組（阿司匹林水溶液，0.06 g/kg）和破骨風低、中、高劑量組（破骨風水提物給藥液，3、6、12 g/kg，下同），每組10只，灌胃給藥，qd，連續4 d。末次給藥1 h后，各組小鼠右耳廓兩面均勻涂抹二甲苯0.05 mL，左耳不涂作為正常耳。1 h后脫頸椎處死小鼠，沿耳廓基線剪下兩耳，用打孔器（直徑8 mm）在雙耳同一位置取下耳片，稱質量，并計算腫脹度及腫脹抑制率[腫脹度（mg）=右耳片質量-左耳片質量；腫脹抑制率（%）=（模型組平均腫脹度-給藥組平均腫脹度）/模型組平均腫脹度×100%]，結果見表4。

由表4可知，與模型組比較，破骨風低、中、高劑量組及陽性組小鼠耳廓腫脹度顯著降低，差異均有統計學意義（P<0.05或P<0.01），表明破骨風水提物對二甲苯致小鼠耳廓腫脹有顯著的抑制作用；且隨著給藥劑量增加，小鼠耳廓腫脹度逐漸降低、腫脹抑制率逐漸升高。

2.4.3 角叉菜膠致小鼠足腫脹實驗 參照文獻[12]方法，取小鼠50只，雌雄各半，分組及給藥方式同“2.4.2”項下，連續給藥7 d。末次給藥30 min后，于小鼠右后足注射0.1%角叉菜膠生理鹽水溶液0.1 mL致炎，分別于致炎后0.5、1、1.5、2 h采用游標卡尺測量并記錄小鼠右后足爪容積，并計算腫脹率[腫脹率（%）=（致炎后足容積-致炎前足容積）/致炎前足容積×100%]，結果見表5。

由表5可知，與模型組比較，破骨風低、中、高劑量組及陽性組小鼠各時間點的足腫脹率顯著降低，差異均有統計學意義（P<0.05或P<0.01），表明破骨風水提物對角叉菜膠致小鼠足腫脹有顯著的抑制作用；且隨著給藥劑量增加，小鼠足腫脹率逐漸降低。

2.4.4 醋酸致小鼠扭體反應實驗 參照文獻[13]方法，取小鼠50只，雌雄各半，分組同“2.4.2”項下；模型組和破骨風低、中、高劑量組均灌胃給藥，連續4 d；陽性組前3天灌胃生理鹽水，第4天灌胃阿司匹林水溶液。末次給藥1 h后小鼠腹腔注射0.6%醋酸0.2 mL，記錄15 min內小鼠的扭體次數，結果見表6。

由表6可知，與模型組比較，破骨風低、中、高劑量組及陽性組小鼠15 min內的扭體次數均明顯減少，差異均有統計學意義（P<0.05），表明破骨風水提物對小鼠腹腔注射醋酸引起的疼痛具有顯著的抑制作用；且隨著給藥劑量增加，小鼠扭體次數逐漸減少。

2.4.5 熱板法致小鼠疼痛反應實驗 參照文獻[13]方法，取雌性小鼠置熱板儀[（55±0.5）℃]，以小鼠自投入至舔后足時間作為痛閾值。取痛閾值為5～30 s的小鼠50只，分組及給藥方式同“2.4.2”項下，連續給藥7 d，分別于末次給藥后30、60 min時測定小鼠痛閾值，結果見表7。

由表7可知，與模型組比較，破骨風低、中、高劑量組及陽性組小鼠的痛閾值在給藥后30 min和60 min時均明顯升高，差異均有統計學意義（P<0.05或P<0.01），表明破骨風水提物能提高小鼠熱板疼痛反應的痛閾值；且隨著給藥劑量增加，小鼠痛閾值逐漸升高。

2.4.6 角叉菜膠致炎小鼠血清和炎性組織中炎癥因子的測定 對“2.4.3”項下小鼠，在角叉菜膠致炎后4 h時進行眼球取血，然后頸椎脫臼處死。自踝關節剪下發炎腫脹的右后足，剝皮剪碎后投入3 mL生理鹽水中浸泡，并不斷振搖1 h。將血樣與炎性組織標本浸泡液離心（3 000 r/min，離心半徑為6 cm，下同）后取上層血清和炎性標本上清液，置于-70 ℃冰箱保存。參照文獻[14]方法，分別取血清和炎性標本上清液各200 μL，加入0.5 mol/L氫氧化鉀甲醇溶液2 mL，50 ℃水浴溫育20 min；加入2.5 mL甲醇，離心后取上清液，以紫外分光光度計測定其在278 nm波長處的吸光度（A），以每毫升血清/每克炎性組織對應的A表示PGE2的含量；另取血清，采用ELISA法檢測IL-1β、TNF-α的含量，嚴格按照試劑盒說明書進行操作，結果見表8。

由表8可知，與模型組比較，破骨風低、中、高劑量組及陽性組小鼠以角叉菜膠致炎后，血清中IL-1β、TNF-α、PGE2及炎性組織中 PGE2的含量均顯著降低，差異均有統計學意義（P<0.05或P<0.01）。

3 討論

3.1 破骨風提取工藝研究

在破骨風主要活性成分尚待深入研究的情況下，干膏率在某種程度上能直觀反映藥材的提取效率。因此，筆者選擇阿魏酸含量和干膏率作為提取工藝優選的評價指標。

本課題組前期選取甲醇、乙醇（不同體積分數）、水、乙醚等為提取溶劑進行考察，結果乙醚對阿魏酸的提取效率較低；甲醇、乙醇、水提取阿魏酸的提取率相當，但甲醇提取液中有一個與阿魏酸保留時間接近的色譜峰，明顯干擾測定；而不同體積分數的乙醇提取與水提取相比較，水提取液色譜圖中阿魏酸分離度高，且干膏率明顯更高。綜合實際生產成本、有機溶劑環境污染等因素，本課題組選擇水為提取溶劑。另外，對回流提取法、水煎煮法、冷浸漬法進行考察，結果發現回流提取法（20倍量水提取2次，每次120 min）所得阿魏酸含量和干膏率明顯高于水煎煮法（20倍量水煎煮3次，分別煎煮120、60、60 min）和水冷浸提法（20倍量水浸提3次，分別浸提48、24、24 h）。因此，確定水回流提取法為本試驗提取方法。

經單因素試驗和正交試驗研究發現，提取次數是影響阿魏酸含量和干膏率的最主要因素，且均有統計學意義。經正交試驗優選，最優工藝為提取時間120 min、液料比16 ∶ 1、提取3次；經驗證試驗證實，該工藝提取效率高、穩定可行。

3.2 破骨風抗炎鎮痛作用研究

阿司匹林為非甾體抗炎藥，抗炎鎮痛作用顯著，常作為陽性對照藥應用于實驗研究[15-16]，因此本實驗采用阿司匹林作為陽性對照，對不同劑量的破骨風水提物進行了抗炎鎮痛作用研究。結果表明，破骨風水提物對二甲苯致小鼠耳廓腫脹、角叉菜膠致小鼠足腫脹、醋酸致小鼠扭體反應和熱板致小鼠疼痛反應均具有顯著抑制作用，其抗炎鎮痛作用明確。

已有研究證實，IL-1β、TNF-α是主要致炎介質，可作用于單核細胞和中性粒細胞而引起炎癥反應；PGE2可與緩激肽等炎癥介質起協同作用，加劇炎癥反應；大量PGE2、白三烯等與氧自由基的作用是致痛的主要原因，為致炎致痛介質[17-18]。本研究表明，破骨風水提物可降低角叉菜膠致炎小鼠血清中的TNF-α、IL-1β、PGE2含量與炎性組織中的PGE2含量，提示這可能為其抗炎鎮痛的作用機制。

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（收稿日期：2017-10-18 修回日期：2018-01-28）

（編輯：段思怡）