木本植物AGAMOUS-like直系同源基因研究進展

周開顏　徐思遠　吳秋亭　石雨　徐啟江

摘要：? 決定擬南芥花器官發育的關鍵調節因子AGAMOUS （AG）控制生殖器官的形成和分生組織決定性，與性別分化、開花結果等過程密切相關。然而，盡管對模式植物和一些重要經濟植物的AG類基因已有深入研究，但關于木本植物直系同源基因研究還有待拓展。深入探究AG基因在木本植物花發育進程中的調控機制對于林木遺傳育種具有重要的指導意義。本文重點闡述了木本植物AG-like同源基因的系統進化和表達模式，并對需深入研究的方向進行了探討。

關鍵詞：? AGAMOUS-like基因;木本植物;花發育;直系同源基因

中圖分類號：? ?S 535. 2? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標識碼：? ?C

基于對模式植物擬南芥（Arabidopsis thaliana）和金魚草（Antirrhinum majus）的MADS-box轉錄因子突變體的研究，提出了被子植物花發育經典的ABC模型，后來逐漸發展為ABCDE模型[ 1 ]。AG是第一個被分離的MADS-box基因，也是擬南芥中唯一的C類基因[ 2 ]，其精細的分子調控機制也一直是植物發育遺傳學研究的熱點。近年來，隨著對木本植物花發育分子機制研究的不斷深入，AG-like基因功能多樣性的事實表明經典花發育模型中C類基因調控花器官發育具有特異性的觀點存在一定局限。

1 裸子植物AGAMOUS-like同源基因系統發育及作用機制

1. 1 裸子植物AGAMOUS-like同源基因系統發育

AG出現在裸子植物和被子植物分化之前，在隨后3億年的進化過程中其功能具有一定保守性。黑云杉（Picea mariana） SAG1在擬南芥中異源表達，可引起萼片向心皮、花瓣向雄蕊的同源轉換的事實表明：控制被子植物花發育和裸子植物孢子葉球發育的遺傳途徑具有同源性[ 3 ]。羅漢松（Podocarpus reichei）與紅豆杉（Taxus globosa）的AG直系同源基因PodAG和TgAG與DAL2具有同源性， 但它們的表達模式不同， 表明紫杉科植物的假種皮與松科植物的珠鱗及羅漢松科植物的肉質鱗被是不同類型的器官。

AG亞家族基因調控種子植物生殖器官發育的功能存在保守性，不同物種AG基因的表達模式不同可使其生殖器官形態差異顯著。系統發育分析表明，杉科植物日本柳杉（Cryptomeria japonica）的CjMADS4、柏科植物羅漢柏（Thujopsis dolabrata）的TdMADS3、歐洲刺柏（Juniperus communis）JcMADS2屬于MIKC-型MADS-box基因家族的AG進化枝，與其他裸子植物的AG類基因例如DAL2、GBM5、GGM3和CyAG聚為一支。但松科和柏科的AG直系同源基因的不同表達模式說明，松科的珠鱗與柏科的種子球果不具有形態同源性，TdMADS3和JcMADS2在種子球果發育晚期時的不育苞片中表達，印證了這些基因可能獲得了新功能[ 5 ]。

1.2 裸子植物AG作用機制

AG基因在裸子植物的生殖器官中表達，將輻射松（Pinus radiata） AG同源基因PrAG1部分結構域敲除并在煙草中異位表達，35S：：MI轉基因煙草株系產生花序結構變化和雄性不育特征，使花粉和種子形成減少，但花序分枝和花數量增加，這為通過轉基因獲得雄性不育株系提供了思路和途徑。

銀杏（Ginkgo biloba）的AG類基因在肉質果實的發育和成熟過程中表達。異位表達銀杏AG基因的番茄，其萼片在近端連接，并伴隨著果實的發育和成熟逐漸變得更厚，出現黃橙色表型，說明它們經歷了向心皮樣結構的同源性轉變。表明裸子植物基因不僅具有調控雌性生殖器官發育的C功能，而且還可能與其他基因共同調控果實發育[ 7 ]。

2 被子植物AGAMOUS-like同源基因系統發育及表達模式

2. 1 木本被子植物AG同源基因的系統進化

在AG基因家族進化過程中發生了2次主要的基因重復事件，其中一次發生在被子植物和裸子植物分化之后，被子植物進化的早期，產生了C進化系和D進化系;另外一次發生在C進化系，薔薇類和菊類分化之后，產生了euAG和PLE進化系。基因表達或編碼序列的變化可以獲得亞功能化或新功能化保留的重復基因，有助于生物體的遺傳穩定性和多樣性。

從薔薇科的核心屬植物太行花（Taihangia rupestris）中分離出TrAG和TrSHP兩個MADS-box基因，分別是euAG和PLE譜系的進化枝成員。原位雜交分析表明，二者主要在雄蕊、心皮和胚珠中表達。當首先觀察到雄蕊原基時，TrAG最初在花分生組織區域中表達，后啟動雄蕊和心皮。而在這個發育階段沒有觀察到TrSHP信號。在心皮發育的晚期階段，TrAG在胚珠、子房以及發育中的柱頭中被檢測到表達，TrSHP表達僅限于胚珠，35S：：TrAG和35S：：TrSHP的轉基因擬南芥植株分別表現出相似的表型。此外，轉基因35S：：TrSHP擬南芥花被脫落受到抑制。酵母雙雜交測定表明TrAG可以與TrSEP3相互作用，而TrSHP不能。說明在真雙子葉植物中euAG和PLE譜系補償方式不同，euAG和PLE旁系同源物TrAG和TrSHP可能通過表達模式的改變和編碼區域中的積累變化而具有亞功能或新功能[ 8 ]。

棕櫚亞科植物Ptychospermatinae總是形成不同大小的花序。然而，從進化的角度來看，它們在雄蕊數量方面表現出很大的差異（幾個到幾十個甚至幾百個）。使用AGAMOUS作為5個核標記之一和3個葉綠體標記（matK序列，ndhA和RPS15-ycf1）相結合，提出了一種新的進化亞族假說，確定了4個主要分支[ 9 ]，各分支成員的雄蕊數量存在差異。

2. 2 木本被子植物AG同源基因表達調控

木本植物尤其是多年生木本植物，從營養生長到生殖生長的過渡，需要經過反復的季節性變化和替代性增長之后才會發生，其調控自身開花和果實發育的機制也更為復雜。對于桃（Prunus persica）的C類器官特征基因PPERAG在不同組織以及果核硬化過程中果實果皮中的表達模式、序列結構和系統發育分析表明：PPERAG基因參與桃花和果實發育，并且在多年生木本樹木中的作用與在模式植物中的功能相容[ 10 ]。原位雜交顯示與擬南芥AG同源的歐洲白樺（Betula pendula Roth） BpMADS6基因在心皮，胚珠和雄蕊中表達，但不在花被片或鱗片中表達。在一些轉基因樺樹植物中，35S：：BpMADS6正義或反義構建體導致花被片數量增加并且在一些雄性花序中完全缺乏雄蕊。這表明BpMADS6參與花的形成，并且和AG的功能同源[ 11 ]。

廣玉蘭（Magnolia grandiflora）種子發育后期，涉及外種皮軟化和顏色變化的相關基因表達，其中包括AG基因[ 12 ]。紅花玉蘭（Magnolia wufengensis） MwAG基因僅在雌雄蕊中表達，在幼葉、外輪花被和內輪花被中不表達。在花器官形態分化過程中，MwAG基因在雌雄蕊原基分化期和成熟期均維持在一個較高水平，且在雄蕊中的表達波峰早于雌蕊，這與雌雄蕊形態分化的時間基本吻合;在花芽分化早期，相同大小的花芽，瓣數越多，MwAG基因在雌雄蕊中的表達量越低，其結果與不同瓣數雌雄蕊分化的時間一致，即瓣數越多，雌雄蕊分化越晚[ 13 ]。黃金樹（Cat alpaspeciosa） AG同源基因CaspAG在花發育過程中同樣僅在雄蕊和雌蕊中表達，而在莖、葉片、萼片和花瓣中幾乎不表達。實時熒光定量PCR分析結果表明：CaspAG基因在雌雄蕊原基分化期至雌雄蕊成熟期均有表達，在雌雄蕊發育成熟期表達量達到最高;且在雄蕊中表達高峰的時間明顯早于雌蕊，這與雌、雄蕊形態成熟的時間也基本吻合。與紅花玉蘭的表達模式基本相似[ 14 ]。

石榴（Punica granatum）在胚珠發育停止的關鍵階段，顯示出了功能性雄花（function male flower，FMF）和雙性花（bisexual flower，BF）之間AG類同源基因（Gglean028014，Gglean026618和Gglean028632）表達模式的差異[ 15 ]。馬兜鈴（Aristolochia fmbriata） C類基因AfmSTK的時空表達限于雄蕊，子房和胚珠，表明了保守的雄蕊和心皮同一性功能，與核心真雙子葉和單子葉植物中報道的一致。此外，AfmSTK在器官脫落和開裂區的表達可能與其衰老過程有關[ 16 ]。麻瘋樹（Jatropha curcas）中20多種AGAMOUS類轉錄因子均有助于雌性花胚囊發育[ 17 ]，且qRT- PCR結果表明AG類基因在麻瘋樹（Jatropha curcas）的雄花和雌花中表達水平較高[ 18 ]。

在香蕉（Musa nana）花和果實提取物中發現的一種CArG-box序列結合AG蛋白的DNA-蛋白質互作現象表明AG因子參與香蕉果實成熟和花卉生殖器官發育[ 19 ]。AGAMOUS類轉錄因子的bHLH結構域在番木瓜（Carica papaya）胚性愈傷組織中促進次生代謝產物尤其是苯丙氨酸的合成，進而促進其胚性愈傷組織的分化和體細胞胚的發生[ 20 ]。

甜櫻桃（Prunus avium） AG亞家族基因PaMADS5在花的雄蕊和心皮中表達，但表達量受赤霉素的影響，隨著赤霉素處理濃度的升高，PaMADS5的表達逐漸升高[ 21 ]。AG也是藤本植物葡萄（Vitis vinifera）簇緊密化的關鍵基因，因為它影響了赤霉素基因的表達，導致簇長度和漿果大小增加[ 22 ]。

毛果楊（Populus trichocarpa） AG直系同源基因PTAG2的第二內含子與最小35S啟動子序列融合創建出兩個人工啟動子fPTAG2I （PTAG2內含子序列的正向）和rPTAG2I （PTAG2內含子序列的反向取向），由rPTAG2I啟動子驅動表達白喉毒素A （DT-A）基因的轉基因煙草在溫室條件下產生了無花，中性（無雄蕊和無心皮）和無心皮3種花粉消融表型，這些轉基因品系的營養生長類似于野生型植物的營養生長，rPTAG2I人工啟動子在營養組織和器官中沒有可檢測的活性，即rPTAG2I：：DT-A基因可產生保持正常營養生長的無花楊，這一無花果性狀對于防止花粉和種子介導的轉基因流動具有重要意義[ 23 ]。研究者還發現，毛果楊（Populus trichocarpa）轉錄區“基因體甲基化”的基因甚至比啟動子甲基化的基因表達量低，即基因體甲基化對轉錄的抑制作用比啟動子甲基化更強，且在雄性柔荑花序中，基因體甲基化比啟動子甲基化更頻繁。這一結論說明：在表觀水平上存在一個更加新穎的策略調控被子植物柔荑花序的發育[ 24 ]。AGAMOUSlike2基因對于解除櫻桃（Prunus pseudocerasus）休眠也顯示出顯著的表觀遺傳作用[ 25 ]。

3 AG同源基因與重瓣花表型效應

對于星花木蘭（Magnolia stellata） AG直系同源基因MastAG，mastag 2和mastag 3表達分析表明：三種選擇性剪接亞型僅在發育的雄蕊和心皮中表達，MastAG的功能類似內源AG，可確定心皮的身份，mastag 2和mastag 3關鍵域或子域缺失導致C功能的喪失。然而，在擬南芥中異位表達mastag 2產生的花萼片轉變為心皮，但沒有花瓣和雄蕊，而異位表達mastag 3的株系類似于花突變體表型，并產生雙花。說明星花木蘭（Magnolia stellata） AG直系同源基因的表達變化可導致花瓣數量增加的“重瓣花（double-flower）”表型[ 26 ]。

上臈杜鵑（Tricyrtis macranthopsis）的雄蕊和心皮轉化為花瓣狀器官也與AG同源基因TrimAG的表達有關，但基因組DNA的Southern印跡分析表明，雙花期品種和野生型之間沒有顯著差異。啟動子和AG內含子II序列的分析未鑒定雙重花期栽培品種中的任何關鍵突變序列，于是Ahmad等[ 27 ]猜想第3輪和第4輪中TrimAG表達降低可能是由于AG表達或轉錄沉默調控網絡中的一個基因發生突變，引起該網絡中的TrimAG啟動子/內含子序列甲基化， 即該突變影響了杜鵑發育的表觀遺傳調控。

玫瑰（Rosa hybrida） C功能基因的同源物RhAG的沉默與低溫促進玫瑰花瓣數量增加的表型相似。低溫提高了原本高甲基化的RhAG啟動子的甲基化水平，限制了雄蕊中RhAG的表達 [ 28 ]。

4 展 望

MADS-box基因對花發育的調控機制一直是近些年分子發育生物學研究的熱點，隨著AG類基因在模式植物以外的一些木本植物中表達調控模式的逐漸清晰，也迎來了更多未知的問題，同時也使AG研究領域變得更寬。

以山茶花（Camellia japonica）為研究材料，通過轉基因途徑對家族類基因的功能研究發現，C類基因CjAG1可以調控雄蕊及花瓣的發育，這種表達特征與植物花器官發育模型中類基因的表達特征完全不符[ 29 ]。以蘋果（Malus domestica）各組織為研究材料，通過研究類基因的表達特性[ 30 ]，說明MdMADS15基因不僅在蘋果的生殖器官中表達同時在蘋果的葉片以及葉芽中也表達。AG基因的表達也能夠在梅（Prunus mume）的萼片檢測到[ 31 ]。

此外，茶樹（Camellia sinensis） CSAG基因在轉基因煙草株系的雄蕊中的表達低于雌蕊或與雌蕊齊平，花瓣顏色變成了淺粉色，并且茶樹花芽的和盛花期的萼片、花瓣、雄蕊、雌蕊以及茶樹幼果和芽葉中都有表達，但各組織中的表達程度不同[ 32 ]。原位雜交研究顯示，茶樹（Camellia sinensis） AG類基因只是在花芽形成之后，雄蕊和心皮起始前，在第3和第4花輪具有較強的表達，它并不干擾植物的正常營養生長[ 33 ]。以上研究均說明：AG類基因在木本植物中的表達調控機制遠比我們想象中的復雜得多，很可能是多條途徑綜合作用的結果，詳盡的機制還需更進一步研究。

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The Research Progress of AGAMOUS-like Orthologous

Genes in Woody Plants

ZHOU Kaiyan

（College of Life Science， Northeast Forestry University，? ?Heilongjiang Harbin 150040）

Abstract AGAMOUS（AG）， the key regulator of floral organ development in Arabidopsis， controls the formation of flower reproductive organs and the decisive nature of meristems， and is closely related to the processes of plant sex differentiation and flowering. However， there are in-depth study of AG-like gene in model plants and some important economic plants， the research of AG-like orthologous genes in woody plants remains to be expanded. It has important guiding significance for forest genetic breeding to explore the regulation mechanism of AG-like gene deeply in the flower development process in woody plants. This article focuses on the systematic evolution and expression patterns of some AG-like homologue genes in woody plants， and discusses the direction for further research.

Key words AGAMOUS-like;? Woody plants;? Flower development;? Orthologous genes