冷飯團不同部位揮發性成分及抗氧化活性分析

楊艷　高漸飛

摘要： 為較全面地認識冷飯團（Kadsura coccinea）植株揮發性成分及其抗氧化活性，該研究以其根、莖、葉為材料，采用水蒸氣蒸餾提取法（方法a）和頂空-固相微萃取法（SPME）（方法b）結合氣相色譜-質譜聯用技術（GC-MS）與計算機檢索技術，對冷飯團植株各部位揮發性成分進行了提取分析，并采用DPPH法對其抗氧化活性進行測試。結果表明：（1）兩種提取方法檢測出的揮發性成分種類及含量存在一定差異，用方法a和方法b分別在根、莖、葉中共鑒定出揮發性化合物98和117種；其中根中分別有59與68種 （占總揮發性物質的83.5%， 93.8%）、 莖中54和56種 （占總揮發性物質的88.9%， 94.9%）、葉中36和42種 （占總揮發性物質的89.6%， 97.7%）。（2）根、莖、葉中兩種方法檢出共同化合物種類及含量基本相同，主要有石竹烯、蒎烯、欖香烯、畢澄茄油烯、古巴烯、畢澄茄烯、d-苦橙花醇等，這些成分也是各部分揮發物的主要成分（含量超過70%）。（3）根、莖、葉中揮發性物質質量濃度達到20 mg·mL-1時，清除DPPH自由基效率均超過97%，表現出很好的抗氧化活性。

關鍵詞： 冷飯團植株， GC-MS， SPME， 抗氧化活性， 揮發性成分

中圖分類號： Q946文獻標識碼： A文章編號： 1000-3142（2018）07-0943-10

Abstract： Volatile components antioxidant activities of Kadsura coccinea and were comprehensively studied. The volatile compounds from three different parts which were roots， stems and leaves of K. coccinea were extracted by steam distillations （Method a） and headspace solid phase micro-extraction （SPME） （Method b）. Volatile components of K. coccinea were analyzed by combining gas chromate-graphy-mass spectrometry （GC-MS） and the technology of computer retrieva. Antioxidant activities of volatile components were tested by DPPH free radical scavengng activity. The results were as follows： （1） There were some differences between species and contents of volatile components. And 98 and 117 volatile compounds were identified from three parts of K. coccinea through methods a and b. Among them， there were 59 and 68 kinds volatile components （accounting for 83.5%， 93.8% of root total content） in root， 54 and 56 species volatile components （accounting for 88.9%， 94.9% of stem total content） in the stem and 36 and 42 species in the leaf （accounting for 89.6%， 97.7% of leaf total content）. （2） Species and contents of volatile components of three parts of K. coccinea through methods a and b were basically the same. The main volatile components were caryophyllene， pinene， elemene， cubebene， copaene， cadinene and d-Nerolidol（contents ≥70%）. （3） Scavenging efficiency for DPPH free radical was more than 97% when the concentration of volatile components of root， stem and leaf of K. coccinea reached 20 mg·mL-1， and volatile components of K. coccinea showed good antioxidant activity.

Key words： Kadsura coccinea， GC-MS， SPME， antioxidant activity， volatile component

冷飯團（Kadsura coccinea），別名黑老虎，系木蘭科南五味子屬植物，是我國原產的一種集食用、藥用、觀賞、綠化于一體的珍稀植物資源。主要分布于貴州、湖南、云南、四川、廣西、廣東等地；為多年生常木質藤本，全株無毛；葉臘質，長圓形至卵狀披針形，長7～8 cm，寬5～15 cm，全緣；根肉質，有香味；雌雄同株，單性花，全年均有花，花呈粉紅色或深紅色；無設施栽培條件下4月底至5月初開花能正常結果；果實為集合果，單果重50～480 g，近球形，表面似足球，幼果青綠色，成熟時紅色或紫紅色，果實10月底—11月上旬成熟。研究證實，冷飯團根莖提取物具有不同程度的降低膽固醇、降血脂，抗肝纖維化、消炎、抗血小板、抗 HIV 病毒、抗衰老（李志春等，2011；李文勝等，2010；李艷等，2014；艾菁和李于善，2005；方林其， 2014； 陳敏等， 2014； Yeon et al， 2014； 朱輝等， 2015； 劉玖石等， 2014； 劉海濤等， 2014）等多種藥理作用，從而受到藥用領域的廣泛關注。近幾年，因其果實外觀型狀奇特、色澤艷麗吸引了大量消費者，并引發一定程度的種植熱；研究者也從營養成分、微量元素等方面證實冷飯團是一種保健和藥用價值較高的水果（高漸飛等，2016；彭富全和鄧慧怡，2006），這為冷飯團作為水果開發提供很好的支持，當前種植面積就正在逐年加速擴大。

冷飯團藥用部位主要是根（陳道峰等，1993；李曉光和羅煥敏，2003；里二和郭紹榮，1995；陳奇，1998），其他部位開發利用還未見到報道。冷飯團根中的化學成分和揮發油已有關注過 （艾菁和李于善，2005；彭富全和鄧慧怡，2006），但由于產地不同，樣品處理及研究方法不同，研究結果間對照和可比性不強；測試部位也未涉及到莖和葉。從資源可持續角度考慮，根的利用必然會誘導資源的采挖，從而威脅種質資源的安全。此外，伴隨著冷飯團人工栽植面積的擴大，每年修剪遺棄的枝葉量也逐年劇增，這些枝葉有何利用價值？如何利用？都是丞待解決的問題。為此，本研究以同一產地同一批樣品為材料，通過水蒸氣蒸餾提取法和SPME法，結合GC-MS技術，全面解析植株各部位（根、莖、葉）揮發性成分，并進一步研究其抗氧化活性，為其資源綜合充分利用提供更為全面的數據支持。

1材料與方法

1.1 材料與儀器

材料：冷飯團植株來源于貴州省錦屏縣，為已結實野生植株，經鑒定為木蘭科南五味子屬植物冷飯團（Kadsura coccinea）。

儀器：GC-MS聯用儀（美國，Agilent 公司，HP 6890/HP 5975 C）；彈性石英毛細管色譜柱（ZB-5MSI，30 m × 0.25 mm ×0. 25 μm）；手動固相微萃取裝置（美國，Supelco公司）；萃取纖維頭（2 cm～50/30 μm）；JA-2003精密電子天平（上海恒平科技有限公司）；揮發油萃取裝置；SB25-12DTD型超聲波（寧波新芝生物科技有限公司），恒溫水浴鍋，揮發油提取器。試劑：純凈水，乙醚（分析純），正己烷（分析純），無水硫酸鎂（分析純）。

1.2 方法

1.2.1 揮發性物質提取水蒸氣蒸餾提取法（方法a）：將新鮮的冷飯團根、莖、葉搗碎，準確稱取500 g于圓底燒瓶中加入2 000 mL的蒸餾水，浸泡過夜，超聲30 min，熱回流提取4 h，得到黃色的油狀液體，分別將冷飯團根、莖、葉揮發油用乙醚萃取，無水硫酸鈉處理后過濾，收集冷飯團根、莖、葉部分的揮發油，分別稱重為2.67、2.98、3.15 g，將處理好的揮發油進行GC-MS分析。

SPME法（方法b）：將新鮮的冷飯團植株根、莖、葉分離，進行搗碎，分別稱取5 g置于固相微萃取儀中，插入纖維頭手動進樣器，120 ℃ 萃取 50 min，移出萃取頭， 插入氣相色譜儀進樣口（250 ℃）中，熱解吸 6 min左右，進樣完成，進行GC-MS分析。

GC-MS分析條件包括（1）GC： 進樣口溫度為250 ℃，載氣為高純度氮氣，流速為 1.0 mL· min-1；柱前壓為0.053 MPa 左右，不分流進樣，溶劑延遲1 min左右，采用歸一法計算各化合物的相對含量。（2）MS： EI源，質量范圍為m/z 29～450 amu，電子能量為70 eV，四級桿溫度為150 ℃，倍增器電壓為1 247 V；譜庫，Wiley 275和NIST 05。

1.2.2 抗氧化活性測試以Vc為抗氧化標準物質，通過DPPH自由基的清除率體現冷飯團各部位揮發性成分的抗氧化活性。將冷飯團根、莖和葉提取的揮發油用無水乙醇充分溶解，配成1、2、4、8、10、20、40 mg·mL-1的供試樣品，準確移取供試樣品溶液2 mL于10 mL具塞試管中，加入2 mL的 DPPH溶液（CDPPH 2 mmoL·L-1），搖勻，避光水浴30 min，用紫外可見分光光度計測定最大吸收波長為517 nm，并在該波長下測定樣品的吸光度Ai （以80%乙醇溶液為參比）。同時測定2 mL DPPH與2 mL 80%乙醇溶液混合后的吸光度Ac，以及2 mL供試樣品與2 mL 80%乙醇溶液混合后的吸光度Aj。平行測定2～3次，根據公式計算抑制率。抑制率越大，則表示該試樣的抗氧化活性越強。抑制率=[1-（Ai-Aj）/Ac]×100%。

2結果與分析

2.1 不同部位揮發性成分

通過方法a得到冷飯團根、莖、葉的出油率分別為0.534%、0.596%和0.630%。揮發油鑒定出化合物98種，其中根中59種>莖中54種>葉中36種；其化合物含量比例高低與之相反，具體為根（83.5%）<莖（88.9%）<葉（89.6%）。三個部分相同化合物18種，主要為石竹烯、畢澄茄烯、蒎烯、蛇床烯等15種烯類化合物以及d-苦橙花醇，這些化合物占方法a檢測到的總揮發成分的73.1%，是植株主要的揮發性成分。

通過方法b檢測鑒定出化合物117種，其中根中檢測到68種>莖中56種>葉中42種，其化合物含量比例高低表現為根（93.9%）<莖（95.0%）<葉（97.7%）。相同化合物20種，主要化合物與方法a檢測結果基本一致，共同化合物占方法b檢測到的總揮發成分的72. 01%，亦是冷飯團植株主要的揮發性成分。與方法a相比，方法b多檢出19種化合物；其中根中10種，其含量總和為0.10%；莖中3種，含量為0.12%；葉中6種，含量為0.08%，這些成分含量都較低。

從歸屬種類看，兩種方法的揮發性成分種類無明顯差異，都以烯類化合最多，不同部位含量均超過73.0%，其次是醇、烷、醛、酮、酯、酚。方法a在三個部分中沒有解析得到酚類物質（圖1-圖3和表1）。

兩種方法檢出結果存在異同性，方法b檢出化合物數量、含量、種類均高于方法a，但兩種方法在不同部位檢出的化合物數量及含量的差異規律一致，主要構成化合物也相同。存在差異的原因可能是方法a需要較多的原料，浸泡不充分或者提取溫度達不到其穿透植物細胞的能力，含量偏低的揮發性成分提取不出。另外，方法a中揮發油的收率相對低，所需時間較長，難保持揮發油完整的香味也是可能原因之一。

2.2 不同部位抗氧化活性

由圖4可知，冷飯團根、莖、葉對DPPH 自由基清除率在1～10 mg·mL-1范圍內呈現明顯的劑量—效應關系，之后隨著質量濃度的繼續提高，超過10 mg·mL-1以后趨于平緩；各部位均能達到91% 以上清除效果，但清除率能力存在微小的差距，具體表現為根<莖<葉。在質量濃度為20 mg·mL-1時，清除效率穩定在95.6%～98.6%；濃度升高至40 mg·mL-1 各部位清除效率均超過97.2%。冷飯團根、莖、葉抗氧化能力的IC50在3.96～4.30 mg·mL-1之間，分別為4.31、4.04、3.96 mg·mL-1；Vc的IC50為9.62 μg·mL-1。盡管各部位揮發油的抗氧化能力與強氧化劑Vc相比較差距較大，但表現出的抗氧化性較強。其中，莖和葉都比根具有根具有更好的對DPPH 自由基清除率，這與莖和葉揮發性成分中化合物總含量，尤其烯類物質含量均高于根的特征是一致的。

3討論與結論

兩種方法檢出結果存在異同性，方法b（SPME法）檢出化合物數量、含量、種類均高于方法a（水蒸氣蒸餾法）；兩種方法在不同部位檢出的化合物數量及含量的差異規律一致，主要構成化合物也相同。相互比較，SPME法能夠提取出水蒸氣蒸餾法不能蒸餾出來的成分，且具有用時短，操作步驟少、污染少等優勢；但其更適合僅對于揮發性成分的研究分析，而水蒸氣蒸餾法對植物揮發油的實際利用意義更大。

兩種方法檢測得到冷飯團根、莖、葉中揮發性成分主要構成成分基本相同，都是烯類化合含量最高（超過73%），其余依次為醇類、烷類、醛類、酮類、酯類、酚類。烯類揮發性成分極為溫和、親膚，能消炎、止咳和祛痰，抗自由基的活性很強，也是植物香氣的主要來源。從單個化合物成分看，含量較多的有石竹烯、蒎烯、欖香烯、畢澄茄油烯、古巴烯、畢澄茄烯、d-苦橙花醇等。因此，可借鑒根現有成熟的利用途徑，對根、莖進行開發利用。

由檢出結果可知，冷飯團植株不同部位化合物數量呈現出根>莖>葉的特征，但化合物含量卻與之相反，即根<莖<葉；對DPPH 自由基清除率表現出與含量比例大小一致的趨勢。冷飯團莖和葉在化合物含量和抗氧化活性方面都比根更具利用優勢，如莖、葉提取液在食品及化妝品中可作為天然抗氧化添加劑，實現資源綜合可持續性利用。

總體上，所測得冷飯團根、莖、葉主要揮發性成分中，大部分具有保健和藥用的功效。如：石竹烯對皮膚炎癥具有較好療效，具有一定的平喘作用，是治療老年慢性支氣管炎藥物的有效成分之一，也具有鎮咳、祛痰和抗真菌作用（黃羅生等，2009），檢測的三個部分均有11%以上的含量，葉中高達33.3%，具有較高利用價值。蒎烯具有鎮咳、祛痰和抗真菌作用，其葉中蒎烯含量達9.7%，可作為藥品和化工提取的良好原料（郭曉恒等，2011）；欖香烯有抗癌作用、具有良好的抗腫瘤活性（福乃武等，1984； 楊驊，1996），其莖中蒎烯含量為6.4%，藥用價值突出。此外，根、莖、葉揮發性物質都具有較好清除DPPH 自由基功效，其保健功和產品亦可為開發。目前，以冷飯團為原料開發的產品還較少，僅發掘了根莖相關成分的補血、活血、鎮定止痛幾方面藥用價值（陳道峰等，1993；李曉光和羅煥敏，2003；里二和郭紹榮，1995；陳奇，1998），此外可作為養顏美容、抗衰老、防治HBV、護肝、保護心血管、抑制白血病，抗腫瘤、對抗HIV藥物或化學預防用藥。

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