獨行菜LaAP2基因克隆、生物信息學分析及表達分析

李艷紅 曾衛(wèi)軍 李金玉 葛風偉 朱艷蕾 趙惠新

摘 要：AP2/ERF是廣泛存在于植物中一類重要的轉錄因子，調控一些參與非生物脅迫相關基因的表達，幫助植物提高逆境脅迫能力。為了深入探討LaAP2在獨行菜耐受低溫萌發(fā)及幼苗耐受低溫生長中的功能，該研究基于前期對獨行菜（Lepidium apetalum）轉錄組數據庫分析，克隆獲得一個顯著上調表達的AP2/ERF家族序列LaAP2。該基因cDNA全長為1 005 bp，編碼氨基酸序列包含一個AP2和一個B3結構域，屬于AP2/ERF轉錄因子RAV亞家族。推定的LaAP2蛋白分子量為37.744 67 kD ，等電點為9.49。該蛋白氨基酸序列同亞麻薺、擬南芥、油菜等物種顯示出較高同源性，系統(tǒng)進化分析結果表明與擬南芥親緣關系較近。氨基酸序列分析預測表明，LaAP2基因所編碼的蛋白不具備信號肽區(qū)段，無跨膜區(qū)，不屬于分泌蛋白，可能為親水性蛋白；定位于細胞質的可能性為56.5%，定位于細胞核的可能性為21.7%；其主要二級結構元件為無規(guī)則卷曲、延伸鏈、α螺旋。Realtime PCR分析獨行菜幼苗中LaAP2在低溫4 ℃處理下的表達，顯示LaAP2表達受低溫脅迫呈先下降后升高趨勢。這表明LaAP2在獨行菜幼苗抵抗低溫脅迫中起調控作用。

關鍵詞：獨行菜，AP2/ERF轉錄因子，LaAP2基因克隆，序列分析，表達分析，低溫耐受，分子生物學

中圖分類號：Q943.2

文獻標識碼：A

文章編號：10003142（2018）06076209

Abstract：AP2/ERF is a kind of important transcription factors widely existing in plants. AP2/ERF regulate the expression of some genes involved in abiotic stress，and help plants improve the ability of adversity stress. We obtained a gene LaAP2 by cloning a significantly upregulated expression AP2/ERF family gene sequence by RTPCR technology，based on the previous analysis of Lepidium apetalum transcriptome database. Bioinformatics analysis of LaAP2 encoded amino acid sequence composition，physical and chemical properties，structure，hydrophobicity，transmembrane region，signal peptide，subcellular localization and secondary protein structure. Realtime PCR was used to detect the expression of LaAP2 gene at 4 ℃ low temperature stress. The result showed that the fulllength cDNA of the gene was 1 005 bp，and the encoded amino acid sequence contains a AP2 and a B3 domain，belonging to the AP2/ERF transcription factor RAV subfamily. The molecular weight of putative LaAP2 protein was 37.744 67 kD and the isoelectric point was 9.49. The amino acid sequence has high homology with Camelina sativa，Arabidopsis thaliana and rape. Phylogenetic analysis showed that the genetic relationship was close to that of A. thaliana. The amino acid sequence analysis showed that LaAP2 gene encoding protein had no signal peptide segments，no transmembrane region，did not belong to the secreted protein. It could be the hydrophilic protein. The possibility of localization in cytoplasm was 56.5%，and in nucleus was 21.7%. The main structural elements were random coil，extending strand and alpha helix. We analyzed the expression of AP2/ERF gene in Lepidium apetalum seedlings under 4 ℃ low temperature stress through Realtime PCR technology，which showed that LaAP2 gene expression was decreased firstly and then increased. The results suggest that LaAP2 play a role in regulating the resistance of low temperature stress in Lepidieae seedling. This study lays the foundation for further study on the function of LaAP2 on the L. apetalum seed germination and seedling growth in tolerance to low temperature.

Key words：Lepidium apetalum，AP2/ERF transcription factor，LaAP2 gene cloning，sequence analysis，expression analysis，low temperature tolerance，molecular biology

獨行菜（Lepidium apetalum）為十字花科獨行菜屬植物，分布非常廣泛。生活在新疆北部的獨行菜能耐受早春低溫進行種子萌發(fā)及幼苗的生長，屬典型的早春短命植物（劉彭等，2007）。已有研究發(fā)現，獨行菜幼苗具有很強的低溫耐受能力（趙惠新等，2010；楊娜等，2015），但其耐受低溫進行生長的機制目前尚不清楚。轉錄因子在植物體生長發(fā)育和植物抵御生物或非生物脅迫過程中起著重要的調控作用。在不同的脅迫環(huán)境下，激活的轉錄因子也不完全相同（Boulikas，1994）。AP2/ERF類轉錄因子是廣泛存在于植物中的一類轉錄因子，在逆境誘導基因的表達中起著信號轉導的作用（崔喜艷等，2015）。AP2/ERF家族轉錄因子蛋白序列含有1或2段由60～70個氨基酸殘基組成的AP2/ERF結構域，依據結構域的數目和結構域特點不同分為DREB、ERF、AP2、RAV 4個亞族（Sakuma et al，2002）。DREB亞族和ERF亞族僅含有1個AP2結構域，AP2亞族含有2個AP2結構域，RAV亞族含有1個AP2結構域和1個B3結構域（Nakano et al，2006）。DREB亞族可以調節(jié)植物抵抗干旱和低溫等非生物逆境（Nakashima et al，2000） ；ERF亞族可以調節(jié)植物抵抗干旱和高鹽等非生物逆境脅迫（Koussevitzky et al，2007）；AP2亞族在植物生長發(fā)育過程中具有重要作用（ Boutilier et al，2002 ）；RAV亞族在植物抵御生物和非生物脅迫過程中發(fā)揮重要作用（ Sohn et al，2006 ）。

目前，有關獨行菜AP2/ERF轉錄因子的研究未見報道。課題組前期對獨行菜種子轉錄組進行測序，發(fā)現27條差異基因序列，被注釋為AP2/ERF家族成員基因，相對于萌發(fā)低溫停滯組，在耐受低溫萌發(fā)組的獨行菜種子中，有一個極顯著上調表達的AP2/ERF基因序列，命名為LaAP2 （ 周茜等，2016 ）。在已有研究基礎上，本研究采用RTPCR技術克隆獲得獨行菜LaAP2基因cDNA全長編碼序列，用生物信息學分析LaAP2編碼的氨基酸序列組成、理化性質、結構域、疏水性、跨膜區(qū)、信號肽、亞細胞定位、二級結構等。熒光定量PCR檢測獨行菜幼苗中LaAP2基因4 ℃低溫脅迫下的表達。本研究為進一步揭示LaAP2轉錄因子在獨行菜幼苗耐受低溫中的作用提供參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料

獨行菜種子采自烏魯木齊市鯉魚山，選擇已經成熟并且飽滿的種子，室溫干燥后，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取及cDNA全長克隆 獨行菜幼苗生長10 d后，液氮研磨，Trizol法提取總RNA。根據同源性最高的擬南芥AP2/ERF基因的全長序列，設計引物，擴增獨行菜LaAP2基因，引物序列如表1所示。

擴增條件：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，53 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，30個循環(huán)；72 ℃，10 min；4 ℃，保存。擴增產物送上海生工生物工程有限公司測序。

1.2.2 LaAP2序列的生物信息學分析 測出的DNA序列在NCBI （www.ncbi. nlm.nih.gov BLAST）網站上進行分析；利用DNAMAN軟件對測序獲得核苷酸序列進行拼接和翻譯成蛋白質，并進行氨基酸序列的多重比對分析；ORF Finde程序（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）預測LaAP2蛋白基因的開放閱讀框；Conserved Domains（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）進行蛋白質保守區(qū)分析； Protscale（http：//web.expasy.org/cgibin/protscale/protscale.pl）分析編碼蛋白的親疏水性；ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）分析編碼蛋白質的相對分子量、等電點、親水性等理化性質；TMpred Server（http：//ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html）進行LaAP2蛋白跨膜區(qū)預測；Signal P（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP）對編碼蛋白信號肽進行預測分析（葛風偉等，2016）。PSORT II Prediction（https：//psort.hgc.jp/form2.html）對編碼蛋白亞細胞定位；SOPMA（https：//npsaprabi.ibcp.fr/cgibin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopm.html）預測LaAP2蛋白的二級結構（肖向文等，2014）；利用MEGA 6.0軟件構建LaAP2系統(tǒng)進化樹。

1.2.3 熒光定量PCR分析LaAP2基因的表達 獨行菜幼苗4 ℃低溫分別處理0、6、12、24 h，提取總RNA。參照Realtime PCR試劑盒說明書操作，檢測LaAP2基因的表達。所用儀器為ABI StepOne。引物序列如表2所示。

以獨行菜幼苗的cDNA為模板，克隆、測序后，得到1 005 bp片段（圖2）。ORF Finder程序預測LaAP2蛋白基因的開放閱讀框（ORF），發(fā)現該基因包含一個1 005 bp完整開放閱讀框。DNAMAN軟件分析該基因編碼334個氨基酸組成的多肽（圖3）。

2.2 LaAP2編碼產物同源性分析

對LaAP2基因編碼的氨基酸序列與8個已知物種AP2氨基酸序列進行多重序列比對（圖4）。發(fā)現該基因與亞麻薺CsAP2、擬南芥AtAP2、油菜BnAP2、蘿卜RsAP2、中華菊頭蝠RhsAP2、醉蝶花ThAP2、棉花GhAP2、麻瘋樹JcAP2氨基酸同源性分別為79%、78%、76%、78%、68%、64%、63%、63%。LaAP2基因編碼氨基酸序列N端存在18個氨基酸殘基的DNA結合位點“KGVVPQPNGRWGAQIYEK”，C端存在27個氨基酸殘基的DNA結合位點“GKVWRFRYSYWNSSQSYVLTKGWSRFV”，兩處氨基酸殘基序列在不同植物中具有一定的保守性。

2.3 獨行菜LaAP2理化性質預測及結構域分析

ExPASy ProtParam預測表明，獲得的LaAP2編碼氨基酸的理論分子量37.744 67 kD；理論等電點pI為9.49；蛋白質分子式為C1665H2638N482O505S8，不穩(wěn)定系數為36.76，表明該蛋白為穩(wěn)定蛋白。脂溶指數為73.77，總平均親水性的數值為-0.587，預測LaAP2為親水性蛋白。

Conserved Domains進行蛋白質保守區(qū)分析，發(fā)現LaAP2基因編碼氨基酸序列含有一個AP2（63～118位氨基酸）結構域和一個B3（187～293位氨基酸）DNA結合結構域（圖4），屬于典型的AP2/ERF類轉錄因子RAV亞家族基因。

2.4 獨行菜LaAP2的親水性/疏水性

Protscale分析結果（圖6）表明，獨行菜LaAP2親水性部位較多，疏水部位少。LaAP2蛋白的親水性/疏水性的最大值為176位的Val 1.889（疏水性最強），最小值為328位的Cys -3.233（親水性最強）。總體而言，與前面氨基酸理化性質預測的結果一致，LaAP2蛋白屬于親水性蛋白。

2.5 獨行菜LaAP2的跨膜區(qū)、信號肽及亞細胞定位

TMpred Server進行LaAP2蛋白跨膜區(qū)預測，表明該蛋白不具有跨膜區(qū)，屬于非跨膜蛋白。

Signal P對LaAP2蛋白信號肽進行預測分析，圖7結果顯示，LaAP2蛋白不具有信號肽，表明LaAP2不是一個分泌蛋白。

PSORT Ⅱ Prediction亞細胞定位結果顯示，LaAP2定位于細胞質的可能性最高，為56.5%；其次是細胞核，為21.7%；細胞骨架為13%；過氧化物酶體和液泡都為4.3%。LaAP2可能在細胞核或細胞質中發(fā)揮功能。

2.6 獨行菜LaAP2蛋白二級結構預測分析

SOPMA程序對獨行菜LaAP2的二級結構進行預測。圖8結果顯示，LaAP2蛋白的二級結構包含24.55%的α螺旋（82處）、29.94%的延伸鏈（100處）、8.98%的β折疊（30處）、36.53%的無規(guī)則卷曲（122處）。

2.7 系統(tǒng)進化樹分析

選取GenBank上7個物種的AP2序列，利用MEGA6.0軟件構建進化樹（圖9），發(fā)現獨行菜LaAP2與擬南芥AtAP2（NP_189201）形成的小分支，再和花椰菜BoAP2（XP_013599419）與油菜BnAP2（XP_013644813）分支組成一個大分支，而亞麻芥ClAP2（XP_010495155）、蕪菁BrAP2（XP_009148531）、醉蝶花ThAP2（XP_010528045）聚在一起位于另一個分支中。LaAP2與擬南芥的同源性最高，可信度達97%。

2.8 獨行菜幼苗冷脅迫下LaAP2基因表達分析

獨行菜幼苗4 ℃處理6 h后，LaAP2表達量只有對照的0.35倍，12 h后表達量是對照的0.16倍，24 h后表達量比12 h時表達量提高了8.4倍，是對照的1.4倍（圖10）。

3 討論

當植物受到干旱、高鹽、低溫等生物或非生物刺激后，首先會激活脫落酸、乙烯等信號途徑，進而激活轉錄因子的表達，再通過轉錄因子結構域內的反式作用元件特異性結合到下游靶基因啟動子區(qū)域的順式作用元件上，來激活或抑制下游功能基因的表達來完成調節(jié)作用（崔喜艷等，2015）。AP2/ERF是植物中一個大的轉錄因子家族。隨著目前測序技術的快速發(fā)展，已有多種植物的AP2/ERF轉錄因子被分離鑒定出，如擬南芥、玉米、水稻、大豆等（崔喜艷等，2015）。它們在調控植物抵御干旱、高鹽、低溫等非生物脅迫中的功能不斷被證實（Wang et al，2011；Abogadallah et al，2011；Shinwari et al，1998））。

由于AP2/ERF轉錄因子在植物應對低溫脅迫響應方面具有重要的調控作用，該研究克隆了獨行菜AP2/ERF轉錄因子家族中一個低溫處理后顯著上調表達的轉錄因子LaAP2。獲得的LaAP2 cDNA全長序列長度為1 005 bp。生物信息學分析，LaAP2基因編碼334個氨基酸。 LaAP2編碼氨基酸序列具有一個AP2結構域和一個B3結構域，屬于AP2/ERF轉錄因子中RAV亞家族。推定的LaAP2蛋白分子量為37.744 67 kD，等電點為9.49。該蛋白氨基酸序列同亞麻薺、擬南芥、油菜等物種顯示出較高同源性，系統(tǒng)進化分析表明與擬南芥親緣關系較近。氨基酸序列分析預測表明，LaAP2基因所編碼的蛋白不具備信號肽區(qū)段，無跨膜區(qū)域，不屬于分泌蛋白，可能為親水性蛋白，其主要二級結構元件為無規(guī)則卷曲、延伸鏈和α螺旋，定位于細胞質中的可能性高于細胞核中。轉錄因子一般存在于細胞核內（阮先樂等，2017），LaAP2蛋白存在的具體位置在下一步實驗中仍需進一步通過亞細胞定位明確。

低溫作為外界的一種非生物脅迫對植物的生長具有不利的影響。為了抵抗這種脅迫，植物具有響應脅迫刺激的復雜的調節(jié)途徑（崔喜艷等，2015）。植物在受到低溫脅迫后，首先激活的是響應低溫脅迫的一些轉錄因子，進而激活下游效應基因的表達，通過這樣一個過程來應對低溫脅迫對植物帶來的損傷（崔喜艷等，2015）。熒光定量PCR分析了4 ℃低溫處理不同時間獨行菜幼苗中LaAP2轉錄因子基因的表達，顯示LaAP2表達量表現出先降低后升高的現象。這表明低溫脅迫對獨行菜幼苗中LaAP2表達具有重要的影響，LaAP2可能在獨行菜耐受低溫生長中起著一定的調控作用。結合前期課題組對獨行菜表達譜的分析（周茜等，2016；周茜，2016），推測獨行菜中LaAP2轉錄因子與種子萌發(fā)、幼苗發(fā)育及耐受低溫脅迫反應密切相關。該研究為進一步探討LaAP2在獨行菜種子耐受低溫萌發(fā)及幼苗生長中的具體功能奠定了基礎。

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