鹽脅迫下棉花萌發、成苗和產量相關性狀的QTL定位

徐劍文 孔杰 趙君 王為然 劉劍光 朱家輝 王希睿 徐海江 肖松華 阿里甫·艾爾西

摘要：利用感鹽棉花品種泗抗1號和耐鹽棉花新品系蘇S012為親本配置雜交組合，構建F，分離群體和F2∶3。家系。分別調查2個親本和299個F2∶3家系萌發期、苗期以及鈴質量、鈴數、衣分和產量的鹽害率，作為QTL定位的表型數據。在棉花A5、D5、D8、Dl0、A13和D13染色體上共定位到13個耐鹽相關QTL，分別解釋2.81%、15.18%、1.78%、5.39%、2.92%、8.38%、9.65%、5.06%、0.46%、2.17%、2.27%、13. 25%、1.50%的表型變異率。

關鍵詞：棉花;耐鹽性;分子標記;QTL定位

中圖分類號：S562.035.3

文獻標識碼：A

文章編號： 1000-4440（2018） 05-0972-06

提高作物產量和開發新的耕地，是提高農業生產效率的2個重要方式。而鹽脅迫作為一種主要的環境脅迫，是提高土地利用率的重要限制性因素。中國西北、東北及濱海地區的鹽堿荒地和鹽堿障礙耕地總面積超過3.33xl07 hm2.其中具有農業利用潛力的近1.33xl07hm2.占全國耕地總面積的10%以上。棉花作為耐鹽先鋒作物，在鹽堿地廣泛種植，在提高土地利用率上發揮了重要作用。通過現代分子生物學方法進一步提高棉花的抗鹽性，對于發掘鹽堿地利用潛力具有極其重要的意義。

鹽脅迫影響棉花從出苗到成熟各階段，其危害程度最終以產量和纖維品質表現。萌發期，鹽脅迫主要影響種子的吸脹吸水，延緩棉花萌發，并降低萌發率。苗期，鹽脅迫會引起幼苗畸形，阻礙葉綠素合成，尤其是二、三葉期的幼苗對鹽脅迫最為敏感，嚴重時棉花葉片發軟、色暗、功能期短，側根發生少，干物質積累減少，生長緩慢，甚至死苗。現蕾期，鹽脅迫會導致棉花生長勢下降，果枝數目減少，進人生殖生長期延遲。開花期，受鹽脅迫影響，棉花花期縮短，結鈴性降低，并且棉鈴發育受到抑制，鈴質量下降。棉花不同品種之間和同一品種不同生長階段之間的耐鹽性都有明顯的差異。從棉花生育期看，幼苗階段和開花結鈴期對鹽脅迫較為敏感，特別是三葉期前的幼苗。通過傳統育種方式提高棉花耐鹽性的效率低，周期長，投入高。轉基因育種和分子標記輔助育種技術是提高育種進程的有效策略。其中，耐鹽堿基因的發掘是轉基因育種的重要基礎之一。而開發與耐鹽性狀連鎖的分子標記，是分子標記輔助育種的重要組成環節。

本研究利用感鹽棉花品種泗抗l號和耐鹽棉花新品系蘇S012為親本配置雜交組合，構建F，分離群體和F2∶3家系，分別調查2個親本和F2∶3家系的萌發期、苗期以及鈴質量、鈴數、衣分和產量的鹽害率，作為QTL定位的表型數據，用2500對SSR引物篩選在兩個親本間具有多態性的標記，構建棉花遺傳連鎖圖譜，篩選與耐鹽基因緊密連鎖的分子標記，對棉花耐鹽性狀QTL進行定位，為進一步定位克隆棉花耐鹽基因奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

2015年夏季在江蘇省南京市以耐鹽棉花新品系蘇S012為母本、感鹽棉花品種泗抗l號為父本雜交獲得F1代種子。2015年冬季在海南省三亞市種植F1代，自交獲得F2代種子。2016年夏季在南京種植含有299個單株的F2代分離群體，人工自交獲得F2∶3家系。2017年夏季在江蘇省大豐市沿海灘涂鹽堿地種植親本、F1和F2∶3家系。

1.2耐鹽性狀調查

2017年夏季在大豐市稻麥原種場鹽堿地直播種植兩親本和F2∶3家系，設3次重復，土壤含鹽量為0.458%，在相鄰非鹽堿地直播兩親本和F2∶3家系作為對照。播種后10 d統計出苗率，三葉期統計幼苗存活率。吐絮后，調查單株鈴數，計算親本和每F2∶3家系的平均單株鈴數。收取50鈴，調查單鈴質量和衣分。收取親本和每家系全部籽棉，計算產量。計算相對鹽害率，萌發相對鹽害率=（對照出苗率一鹽堿地出苗率）/對照出苗率×100%，苗期相對鹽害率=（對照存活率一鹽堿地存活率）/對照幼苗存活率×100%，鈴質量相對鹽害率=（對照鈴質量一鹽堿地鈴質量）/對照鈴質量x100%，鈴數相對鹽害率=（對照鈴數一鹽堿地鈴數）/對照鈴數×100%，衣分相對鹽害率=（對照衣分一鹽堿地衣分）/對照衣分×100%，產量相對鹽害率=（對照產量一鹽堿地產量）/對照產量×100%。

1.3 F2∶3家系耐鹽性狀的相關性分析

利用SPSS 22軟件，對F2∶3家系的萌發相對鹽害率、苗期相對鹽害率、鈴質量相對鹽害率、鈴數相對鹽害率、衣分相對鹽害率和產量相對鹽害率進行雙變量相關性分析，相關系數選用Spearman，顯著性檢驗選用雙尾檢驗，并對顯著性相關進行標注。

1.4 棉花基因組DNA提取、親本多態性引物篩選

用CTAB法提取蘇S012、泗抗l號和299個F2代單株的基因組DNA。在Cottongen數據庫（ht-tps：//www.cottongen.org/search/markers）中選擇2500對SSR（Simple sequence repeat）引物，由南京金斯瑞公司合成，檢測2個親本基因組之間的多態性，并用多態性引物對F2單株進行PCR擴增檢測。參照張軍等的方法進行PCR擴增、聚丙烯酰胺凝膠電泳和銀染。

1.5 遺傳連鎖圖譜的構建

利用JoinMap3.0軟件對多態性引物進行分析，并參考分子標記的染色體定位信息，構建遺傳連鎖圖譜。利用Windows QTLs Cartographer 2.0軟件的復合區間作圖法檢測棉花耐鹽堿性狀的QTL，進行1 000次隨機抽樣測驗，選擇LOD值≥2.5的QTL，并計算貢獻率（R2）、加性效應（A）和顯性效應（D）。利用MapChart 2.1軟件繪制遺傳圖譜。

2 結果與分析

2.1 親本蘇S012和泗抗1號的耐鹽性

萌發后10 d、幼苗三葉期分別調查親本材料蘇S012和泗抗1號在鹽堿地和非鹽堿地的萌發率、成苗率，并在吐絮后調查親本材料的衣分、單鈴質量、單株鈴數和產量（表1）。結果顯示，受鹽脅迫影響，蘇S012和泗抗l號的萌發率、成苗率、衣分、單鈴質量、單株鈴數和產量都顯著降低。進一步計算相對鹽害率后發現，蘇S012的萌發相對鹽害率、苗期相對鹽害率、衣分相對鹽害率、鈴質量相對鹽害率和產量鹽害率均顯著低于泗抗l號，而泗抗l號的鈴數相對鹽害率顯著低于蘇S012，并且兩親本材料在萌發相對鹽害率、苗期相對鹽害率、衣分相對鹽害率、鈴數相對鹽害率上的差異達到了極顯著水平。說明親本材料蘇S012在萌發期、苗期以及衣分、單鈴重和產量上耐鹽性顯著高于泗抗l號，而在單株鈴數上，泗抗l號的耐鹽性顯著高于蘇S012。

2.2 F2∶3家系耐鹽性狀相關性分析

利用SPSS 22軟件對F2∶3家系的萌發相對鹽害率、苗期相對鹽害率、衣分相對鹽害率、鈴質量相對鹽害率、鈴數相對鹽害率和產量相對鹽害率之間的相關性進行分析。結果（表2）顯示：萌發相對鹽害率與苗期相對鹽害率、衣分相對鹽害率、產量相對鹽害率呈正相關關系，與鈴數相對鹽害率呈負相關關系;苗期相對鹽害率與產量相對鹽害率呈正相關關系，與鈴數相對鹽害率呈負相關關系;衣分相對鹽害率與鈴質量相對鹽害率呈正相關關系：鈴質量相對鹽害率與產量相對鹽害率呈正相關關系：鈴數相對鹽害率與產量相對鹽害率呈負相關關系。

2.3 棉花連鎖圖譜構建

用2 500對SSR引物，檢測兩親本之間的多態性，共篩選到68個多態性位點，多態性頻率為2.72%。用68個多態性SSR引物檢測299個F2∶3家系的基因型，并用Jionmap軟件構建連鎖圖（LOD≥3）。所繪制連鎖圖包含20個標記和8個連鎖群，長度在15.0cM至68.3 cM之間，總長度為259.4 cM.標記間平均距離為21.74 cM，各連鎖群含2至4個標記。根據棉花分子標記數據庫（https：//www.cottongen.org/search/markers）數據，這8個連鎖群被定位在棉花A5、D5、D8、Dl0、A13和D13染色體上，其中D5和Dl0染色體上定位到了2個連鎖群（圖1）。

2.4 棉花耐鹽QTL初定位

分別用F2∶3家系的萌發相對鹽害率、苗期相對鹽害率、衣分相對鹽害率、鈴質量相對鹽害率、鈴數相對鹽害率和產量相對鹽害率，在Windows QTLs Cartogra-pher 2.0軟件中用復合區間作圖法檢測耐鹽相關QTL，共檢測到13個LOD值大于2.5的QTL位點（圖l、表3）。其中用萌發相對鹽害率數據共檢測到1個QTL，命名為qSTG，位于Dl0染色體上，表型貢獻率為2.81%。用苗期相對鹽害率數據共檢測到4個QTL，命名為qSTS-/、qSTS-2、qSTS-3、qSTS-4，分別位于A5、D5、Dl0、D13染色體上，表型貢獻率分別為15.18%、1.78%、5.39%、2.92%。用衣分相對鹽害率數據共檢測到2個QTL，命名為qSTL-1、qSTL-2，分別位于D5和A13染色體上，表型貢獻率分別為8.38%和9.65%。用鈴質量相對鹽害率數據檢測到1個QTL，命名為qSTW，位于D8染色體上，表型貢獻率為5.06%。用鈴數相對鹽害率數據共檢測到3個QTL，命名為qSTBN-1、qSTBN-2、qSTBN-3，分別位于D5、Dl0和D13染色體上，表型貢獻率分別為0.46%、2.17%、2.27%。用產量相對鹽害率共檢測到2個QTL，命名為qSTP-1、qSTP-2，分別位于A5、Dl0染色體上，表型貢獻率分別為13.25%、1.50%。

3 討論

鹽脅迫首先對植物造成持續存在的滲透脅迫，并表現為離子失調引起的毒害和營養虧缺，繼而引起氧化脅迫并導致膜透性改變、代謝紊亂、有毒物質積累，最終影響植物的生長發育和形態建成。植物耐鹽堿性是一個復雜的生物機制，是各種生理生化過程協同作用的結果。在進化過程中，植物形成避鹽和提高耐鹽性2種機制以應對鹽脅迫帶來的危害。避鹽主要包括泌鹽、稀鹽、積鹽和拒鹽4種方式。植物主要通過滲透調節、營養元素平衡和增強抗氧化脅迫，提高耐鹽性。大量相關基因在植物耐鹽機制中起到重要作用，它們主要包括離子轉運蛋白基因、滲透調節相關基因、信號傳導相關基因、細胞抗氧化相關基因等。對這些基因的挖掘，有助于進一步提高植物耐鹽性。

鹽脅迫對棉花從出苗到成熟各時期都有不同的影響，尤其是幼苗期和開花結鈴期更加敏感，鹽脅迫的危害最終表現在產量和纖維品質上。此外，在直播條件下，鹽堿地種植棉花的產量受萌發率、成苗率、單株鈴數、單鈴質量、衣分等多種性狀共同決定。因此，只以棉花苗期萌發率作為耐鹽指標進行QTL定位不能完全發掘耐鹽相關基因。本研究在調查產量性狀的同時，分別調查了萌發率、成苗率、鈴質量、鈴數和衣分5個表型數據，用于QTL定位，為較全面地發掘耐鹽相關基因打下了基礎。相關性分析結果表明，萌發率、成苗率、產量之間存在顯著正相關，而鈴質量和衣分之間也存在顯著正相關。說明應對鹽脅迫對產量的危害，可以通過發掘幼苗期耐鹽相關基因：而應對鹽脅迫對纖維品質的危害，僅僅發掘幼苗期耐鹽相關基因則顯得不足。QTL定位結果也顯示，苗期耐鹽相關QTL qSTS-/、qSTS-3分別與產量相關QTL qSTP一I、qSTP一2定位區間重合。同樣說明通過發掘棉花苗期耐鹽相關基因，可以應對鹽脅迫對最終產量的危害。

鹽脅迫下單鈴質量是影響棉花產量的重要性狀，本研究相關性分析結果表明鈴質量相對鹽害率與產量相對鹽害率呈正相關關系。李建亮也發現，隨著土壤鹽濃度提高，苗期感鹽品種中棉所102和耐鹽品種中棉所103的產量都逐漸減少，并且兩品種間的產量差異隨鹽濃度提高而增加，這種差異主要是由于鹽分的提高顯著降低了單鈴質量和鈴數。此外，本研究中F2∶3群體的鈴質量相對鹽害率與苗期相對鹽害率之間的相關性不顯著。在李建亮的研究中，苗期感鹽品種中棉所102鈴質量性狀的耐鹽性高于耐鹽品種中棉所103，兩品種在苗期的耐鹽性和鈴質量的耐鹽性上沒有直接相關性。因此，提高鹽脅迫下棉花的鈴質量，是增加鹽堿地種植棉花產量的有效途徑。根據F2∶3群體的鈴質量性狀，本研究在棉花D8染色體上定位到1個與鹽脅迫下鈴質量相關的QTL qSTBW，該QTL位點與萌發、成苗相關QTL位點的區間沒有重合。對該QTL的進一步研究和利用將在棉花耐鹽分子育種中發揮積極的作用。

單株鈴數是影響棉花產量的另一個重要性狀。QTL定位結果顯示，鈴數相關QTL qSTBN-1、qSTBN-2、qSTBN-3分別與qSTS-2、qSTG、qSTS-4的定位區間重合，而萌發相對鹽害率、苗期相對鹽害率與鈴數相對鹽害率呈顯著負相關關系。推測原因是因為萌發期和苗期的耐鹽性影響了成苗率，繼而影響了種植密度，從而導致部分耐鹽性較差的株系反而具有更多的鈴數。本試驗從實際生產角度出發，采用鹽堿地直播的方式鑒定群體的耐鹽性。若要揭示影響鹽堿地結鈴性的具體分子機制，需要再采用營養缽育苗后移栽的方式進行鑒定，才能獲得影響鹽堿地結鈴性的更加精確的數據。

棉花基因組總長約為5000 cM.需要約5000個分子標記才能達到遺傳圖譜的表達飽和。本研究所用兩個親本材料均為陸地棉，遺傳背景差異小，多態性SSR標記數量偏少，共篩選到68個多態性位點，多態性頻率為2.72%。因此在遺傳圖譜中，標記間遺傳距離較大，且標記數目較少。在下一步工作中，將通過開發新的分子標記，以及利用極端性狀混池重測序（Bulk segregant analysis-sequence，BSA-seq）技術進一步縮小定位區間、加大遺傳圖譜飽和度。本研究的結果為未來耐鹽相關基因的定位和標記輔助選擇育種工作奠定了理論和實驗基礎。