轉桃PpCuZnSOD基因大豆的耐旱性

楊艷麗 楊勇 李大紅 李鴻雁

摘要：為探索桃（Prun，us persica L.）銅/鋅超氧化物歧化酶基因（PpCuZnSOD）在植物抗干旱脅迫中的作用，應用農桿菌介導法，將PpCuZnSOD基因轉入大豆品種中黃13中。Southern印跡分析證實PpCuZnSOD基因已整合到大豆基因組中。定量PCR分析結果表明，轉基因大豆中PpCuZnSOD表達水平均明顯增加。用150/0 PEG4OOO模擬干旱脅迫時，轉基因大豆種子萌發率與主根長顯著高于非轉基因大豆。在干旱10 d條件下，轉基因大豆與非轉基因大豆相比，超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）和過氧化物酶（POD）活性增加，而丙二醛（MDA）含量下降，葉綠素含量降低較少。活性氧（ROS）染色結果顯示，轉基因植株在干旱脅迫下活性氧少于非轉基因植株。復水后4d，轉基因大豆的成活率顯著高于非轉基因大豆。這些結果表明，PpCuZnSOD能提高大豆的耐旱性。

關鍵詞：轉基因;耐旱性;大豆;Pp CuZn，SOD基因

中圖分類號：S565.103.53

文獻標識碼：A

文章編號： 1000-4440（ 2018）05-0978-06

寒冷、干旱、澇害等環境脅迫可產生有毒自由基，危害農作物生產。活性氧（ROS）對細胞具有潛在的毒性，通過氧化脂質、核酸和蛋白質而破壞正常的新陳代謝。一些研究結果表明，ROS少量存在時，可以作為重要的信號分子發揮作用，參與控制病原體防御、激素信號傳導、應激反應和植物生長發育等過程。然而，當活性氧產生量增加時，它們能夠損傷甚至殺死植物細胞。但是，植物已經進化出一些防御機制來減輕不利環境條件造成的損害。例如，一些ROS清除酶，包括超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）和過氧化還原酶（PRXR），可以清除超氧陰離子（02-）等氧化物，從而保護植物免受環境脅迫。

超氧化物歧化酶（SOD）是參與ROS降解的第一個酶，能把超氧陰離子轉換成H202。SOD有幾種異構體，異構體類別取決于活性位點上的金屬輔因子，例如，錳超氧化物歧化酶（MnSOD）、銅/鋅超氧化物歧化酶（CuZnSOD）、鐵超氧化物歧化酶（FeSOD）和鎳超氧化物歧化酶（NiSOD）等。CuZnSOD是細胞質、細胞核和線粒體膜間隙中的主要自由基清除劑。在脅迫狀態下，SOD活性和其轉錄表達水平增高。有研究結果表明，在干旱和鹽脅迫下玉米和番茄中MnSOD和CuZnSOD高水平表達，這些有較高活性抗氧化酶的植物更耐鹽、干旱或氧化脅迫，高鹽和干旱脅迫能夠改變抗氧化酶水平，在很大程度上提高幼苗的抗逆性。逆境條件下，水稻鹽敏感品種SOD水平顯著高于耐鹽品種。過表達水稻葉綠體OsCu/ZnSOD基因的轉基因株系在NaCl和NaHCO，脅迫下發芽率顯著高于非轉基因株系。也有研究結果表明在煙草葉綠體中增強鋅超氧化物歧化酶的表達后葉綠體對甲基紫精銅（MV）的耐受性也增強。在轉基因馬鈴薯和擬南芥上也有相似的現象。因而，鹽脅迫和干旱脅迫下植物SOD活性的增加是緩解逆境損傷的一個步驟。

大豆是一種重要的農業作物，為人類主要植物蛋白質來源和植物油來源。在環境脅迫下，大豆往往在其細胞中積累活性氧，影響其生長發育和產量。Guttikonda等把擬南芥DREBID轉錄因子導人大豆中，在缺水時，與對照相比，轉基因植株能保持較高的相對含水量，而且存活率顯著高于非轉基因植株。此外，與非轉基因植株相比，轉基因植株還保持了17%～24%的葉片細胞膜穩定性，說明耐旱性增強。李大紅等將苜蓿（Medicago sativa）DREB1基因導人大豆，獲得rd29A和CaMV-35S 2類啟動子驅動的Ms DREB1轉基因大豆，在嚴重干旱脅迫下，這2種啟動子轉基因株系均有一定耐旱能力。秦迪等發現在干旱條件下，8個轉菠菜BADH基因大豆株系葉片中BADH基因表達量較高，轉基因大豆發芽指數高于非轉基因大豆，在8個轉基因大豆材料中有7個增產。魏崍等利用農桿菌介導法獲得過表達AtCBF4基因和過表達Bo WS基因的大豆株系，這2個株系均有很強的耐旱性。本研究將桃PpCuZn，SOD基因通過農桿菌介導法導人大豆基因組中，在干旱脅迫條件下檢測轉基因大豆苗期的耐旱性及其相關生理指標，以期獲得具有一定應用價值的耐旱大豆新種質，為篩選具有育種應用價值的材料奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 植物材料和菌株

大豆品種中黃13號由駐馬店農業科學院提供。大腸桿菌DH5a和根癌農桿菌EHA105菌株均由本實驗室保存。

1.2 質粒載體和試劑

克隆載體pMD-18和DNA聚合酶購自于TaKa-Ra（中國大連）有限公司，pCAMBIA1301為本實驗保存。TRIzol試劑購自Sigma公司，其他試劑為進口或國產分析純。

1.3 方法

1.3.1 質粒構建與轉化 根據GenBank中桃基因序列（XP-021817567）設計引物Pl（5-CG-GATCCATGGTGAAAGGCGTTGCTGTTC-3'） 和 P2（5'- CGAGCTCTCAGTTTTGGAGACCAATAATA-3'），T劃線為相應酶切位點。用TRIzol試劑提取RNA，按說明書方法逆轉錄cDNA第一鏈及雙鏈DNA。PCR反應體系（25μl）為：12μl ddH20，lμI模板，10μlEx Taq Mix，上、下游引物各lμl。反應條件為：95℃預變性5min：95℃變性60s，53℃退火30s，72℃延伸45s，共35個循環;72℃延伸10 min。擴增所得片段連接到T載體上。送上海生工公司測序后，與GenBank序列進行同源性比對。將載有目的基因PpCuZnSOD序列的T載體和表達載體pCAMBIA1301分別用限制性核酸內切酶BamH I、SacI雙酶切（圖1），1.2%瓊脂糖電泳檢測酶切結果。使用DNA回收試劑盒回收目的基因片段和表達載體片段.1.2%瓊脂糖電泳檢測回收效果，將目的基因片段50ng與載體17 ng加入到緩沖液中，加入T4連接酶lμl（10ng/μl），4℃過夜連接。轉化后用PCR與雙酶切檢測質粒構建是否成功。用凍融法將表達載體轉入農桿菌中。

1.3.2 轉基因大豆株系的獲得 大豆轉化采用農桿菌介導的子葉節轉化法。用50μg/ml潮霉素篩選抗性轉基因植株?？剐赞D基因大豆植株經練苗后進行盆栽。

1.3.3 轉基因大豆Southem blot檢測參照Murraym等的CTAB法提取大豆基因組DNA。PpCuZn，SOD基因PCR分析：引物為P3（5-GAATCATCAACT-TCACCCAG-3'）、 P4 （5-CCAATAATACCACAAG-CAAC-3'），模板為大豆基因組DNA，復性溫度為55℃，反應條件同方法1.3.1。用EcoR I內切酶在37℃下酶解大豆基因組DNA。以地高辛隨機標記的PpCuZnSOD基因全長作為探針進行Southem雜交檢測，具體方法參照德國羅氏地高辛說明書（DIG DNALabeling and Detection Kit，Roche）進行。

1.3.4 轉基因植株mRNA RT-qPCR檢測 對陽性植株的PpCuZn，SOD基因表達量進行分析。用TR-Izol試劑提取轉基因大豆葉片RNA.用紫外分光度計測定260 nm吸光度與280 nm吸光度比值，計算RNA濃度。參照SMART cDNA synthesis Kit說明書合成cDNA第一鏈。在ABI 7500實時檢測系統上進行qRT-PCR檢測，試劑為Power Sybr Green PCR試劑（ABI）。熒光定量PCR引物為P5（5- GAAT-CATCAACTTCACCCAGGA-3'）和P6 （5-CCAATA-ATACCACAAGCAACCC-3'）。Actin，基因作為內參，上游引物為5'-TGATGGTGTGAGTCACACTGTACC-3，下游引物為5-GGACAATGGATGGGCCAGACTC-3。反應體系參照文獻。所有PCR進行3個重復，并用同一個條件進行測試。采用兩步法PCR擴增標準程序：50℃下2min，95℃下預變性10min;95℃下15s，60℃下45s，循環40次?；蚩截悢档亩坎捎秒p標準曲線法。

1.3.5 轉基因大豆耐旱性分析 將檢驗正確的轉基因和野生型（對照）大豆種子進行萌發試驗，分別將轉基因大豆與對照用15% PEG4000處理，7d后，記錄主根長及種子萌發率。另外對轉基因與對照大豆進行缺水試驗。將發芽20 d的轉基因與對照大豆苗移到含有砂與土（質量比1：1）基質中栽培7d。然后進行缺水脅迫處理，10 d后，測定其在干旱脅迫下相關生理指標變化。SOD活性測定采用NBT（四唑氮藍）還原法，葉綠素含量測定采用分光光度法，POD活性測定采用比色法.MDA含量測定采用硫代巴比妥酸法，CAT活性測定采用紫外吸收法，具體方法均參照文獻。02和H，O，檢測分別用NBT和DAB（3，3-二氨基聯苯胺）進行染色，參照Yan等方法進行。然后復水4d，計算其存活率。每組每個株系6株。

1.4 數據分析

試驗數據分析使用Excel 2013及SPSS17.0。

2 結果與分析

2.1 轉基因植株分子檢測

通過子葉節轉化再生途徑獲得6個大豆轉基因株系。用特異引物對再生苗進行PCR檢測，均為陽性植株。為了進一步確認轉基因植株，對這6個轉基因株系進行Southern blot檢測。以PpCuZnSOD基因的全長作為探針，對轉基因株系進行Southem雜交驗證，結果顯示6個轉基因株系均有1個拷貝的PpCuZnSOD基因整合到大豆基因組中（圖2）。

2.2 轉基因大豆株系PpCuZnSOD表達量分析

為了檢測目的基因的表達效果，對6個轉基因株系PCR及Southem blot陽性苗進行qRT-PCR檢測。結果顯示轉PpCuZnSOD株系目的基因均能表達，但基因表達量存在較大差異。其中L2、L5株系PpCuZnSOD為過表達，其他株系表達較弱，而野生型植株基本沒有表達。由此可見，PpCuZnSOD基因已經轉到大豆基因組中，且有2個株系表達量較高（圖3）。

2.3 轉基因大豆耐旱性分析

對經過檢測的轉基因大豆及對照種子用15%PEG4000進行模擬干旱處理。7d后，轉基因大豆種子的萌發率和主根長都顯著高于對照（圖4）。對盆栽27 d轉基因植株與對照進行缺水脅迫處理10d，結果顯示轉基因大豆長勢明顯好于對照，葉綠素含量顯著高于對照：復水后，轉基因植株的成活率顯著高于對照（圖4、圖5）。

為了比較大豆轉基因植株和野生型植株的耐旱性，將27日齡的盆栽轉基因植株進行干旱脅迫處理，處理10 d后測定轉基因大豆各株系SOD、POD和CAT活性及丙二醛含量。結果（圖6）表明，各株系與對照差異顯著。干旱脅迫條件下，PpCuZnSOD的過表達植株MDA含量顯著低于對照，而POD、SOD及CAT活性顯著高于對照。說明PpCuZnSOD過表達導致轉基因植株耐旱性提高。

為了進一步檢測轉基因大豆的耐旱性，對轉基因大豆與對照的ROS進行檢測，分別用NBT和DAB進行染色。結果（圖7）顯示，干旱脅迫后，過表達大豆植株葉片顏色明顯淺于對照植株，表明過表達植株中02和H202的積累明顯低于對照植株。說明干旱脅迫下過表達Pp CuZn，SOD基因可增強大豆細胞內活性氧清除能力，使02和H202的積累減少，從而減少細胞受損或細胞死亡，增強植物的耐旱性。

3 討論

干旱是世界范圍內日益嚴重的農業問題。干旱嚴重影響作物產量和品質。通過常規育種方法也能增加大豆的耐旱性，但費力費時，而且遺傳多樣性限制了改進的潛力。分子生物學方法有助于提高作物的耐旱性。許多研究結果表明，導人外源基因能增加植物的耐旱性。Kudo等發現過量表達OSPIL1和DREBIA的轉基因擬南芥植株表現出較高的耐旱性。Hui等將CuZnSOD和APX基因轉入甘薯，提高了甘薯的耐鹽性。本研究將PpCuZnSOD基因轉入大豆品種中黃13中，在干旱脅迫下轉基因植株根系主根長度明顯大于非轉基因對照，耐旱性增強。

植物在干旱脅迫下能產生活性氧（ROS），危害植物生長發育。SOD通過催化O2歧化反應，將其還原為H202，然后，APX將過氧化氫氧化為水和氧。我們發現轉基因大豆中SOD和APX活性均較高。表明轉基因植株清除ROS的能力顯著高于對照。轉基因植物具有較強耐旱表型，例如在干旱脅迫下具有較低的葉綠素損失和脂質過氧化。轉基因植株中CAT、SOD和POD活性的升高降低了干旱脅迫引起的ROS毒性。此外，DAB、NBT染色結果也表明轉PpCuZnSOD基因大豆過氧化氫和超氧陰離子少于非轉基因植株。

SOD在植物對不同類型脅迫的響應中起著重要作用。PpCuZnSOD是一種明顯響應干旱脅迫的SOD，異源過表達可以增強大豆的耐旱性，表明PpCuZnSOD基因在植物響應干旱脅迫過程中發揮著一定作用，這對以后定向培育抗旱優良品種具有參考價值。