豬非典型性瘟病毒與豬流行性腹瀉病毒雙重PCR方法的建立與應用

楊曉宇 徐雷 殷鑫歡 張繼宗 徐志文 朱玲

摘要：為了快速準確地檢測出豬非典型性瘟病毒（APPV）與豬流行性腹瀉病毒（PEDV），根據GenBank中發布的PEDV S2基因和APPV NS3基因的序列，分別選取PEDV S2基因和APPV NS3基因的保守序列，設計、合成了1對特異性引物。通過對體系進行優化，分別擴增出190 bp和500 bp的特異性片段。建立的雙重Rrr-PCR方法對豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、豬瘟病毒（CSFV）、豬輪狀病毒（RV）的檢測均為陰性。對PEDV和APPV的最低檢出量分別為1μl 2.65x103和1μl 3.56x104，對四川遂寧、眉山等地采集到的腹瀉、肌肉震顫的病料進行檢測，PEDV、AP-PV陽性病料檢出率分別為41.18%和11.76%，經分別與特異性檢測APPV和PEDV的單一RT-PCR法檢測結果進行比較分析，符合率均為100%。與單一RT-PCR檢測方法具有相同特異性和重復性，可用于臨床檢測。

關鍵詞： 豬非典型性瘟病毒：豬流行性腹瀉病毒：雙重RT-PCR

中圖分類號：S852.65+1

文獻標識碼：A

文章編號： 1000-4440（2018）05-1081-06

豬非典型性瘟（APP）是豬非典型性瘟病毒（A—typical porcine pestivirus virus，APPV）引起的仔豬先天性震顫（俗稱“抖抖病”），APP在臨床上可以導致出生仔豬全身肌肉震顫、八字腿、嚴重可導致全身震顫，吮乳困難。規模化養殖場豬發病率在5%左右。先天性震顫（Congenital tremor）可以分為A、B兩種類型，B型沒有明顯的組織損傷，A型有明顯的大腦脊柱的組織損傷。根據腦和脊柱的受傷程度可將A型分為I—V5種亞型，其中A-III型先天性震顫是只有在長白豬品種中存在的遺傳性疾病，其特征是髓鞘缺失，少突細胞減少;A-IV型，其特點是腦脊髓髓鞘形成過少引起的;A-V型病例是由敵百蟲中毒引起，常導致小腦發育不全;只有A-I與A-II是傳染病，A-I型是由豬瘟病毒（CSFV）引起的，但是A—II型的病因此前尚未可知。Hause等驗證了APPV是引起仔豬先天性震顫的主要病原，通過分子和血清學檢測，證明了APPV在美國豬群的廣泛存在，隨后，德國、荷蘭、奧地利等多個國家先后發現豬群存在APPV流行。豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemicdiarrhea virus，PEDV）是引起豬流行性腹瀉（Porcineepidemic diarrhea，PED）的主要病原，PED是臨床上引起水樣腹瀉、嚴重腸炎、嘔吐、脫水和食欲下降為癥狀的高度接觸性腸道傳染病。由于其傳染性強和較短的病程，哺乳仔豬的死亡率可達50%～ 90%，給養豬業帶來巨大的損失。1977年，在比利時養豬場分離出一種與腹瀉相關的新型冠狀病毒樣顆粒，隨后在中國、加拿大、德國、日本、韓國等國家相繼報道了該病毒。2009年以來，韓國、日本相繼有PED發生，2010年冬季以來，中國也大規模爆發PED。

APPV和PEDV都是RNA病毒，均可導致出生仔豬發病。母源抗體是保護仔豬預防PEDV的重要手段之一。APPV的感染導致仔豬吮乳困難，嚴重影響仔豬對母乳的攝入，從而導致母源抗體對出生仔豬的保護力不足。為了進一步研究APPV和PEDV兩者之間的感染狀況與疾病的損傷，本試驗建立了同時檢測APPV和PEDV的雙重RT-PCR方法，為疾病診斷提供一個快速、靈敏、高效的檢測方法，為疾病防控提供合理依據。

1 材料與方法

1.1 病毒和病料

豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductiveand respiratory syndrome virus，PRRSV）、豬瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）、豬非典型性瘟病毒、豬流行性腹瀉病毒、豬輪狀病毒（Rotavirus，RV）、大腸桿菌（Escherichia coli）均由四川農業大學動物生物技術中心保存;病料（腸道、腸系膜淋巴結、腦、腹股溝淋巴結）采自四川眉山、遂寧、宜賓、瀘州、自貢等各市規模化養豬場。

1.2 主要試劑

DL2000 DNA Marker、RNAiso plus、Taq Hs、10×Reaction Buffer（Mg2+ free）、dNTP Mix、ddH2 0、pMD19-T載體均購自寶生物工程（大連）有限公司，DNA凝膠回收試劑盒（DNA Gel Extraction Kit）和質粒提取試劑盒（Plasmid Kit I）購自Omega公司。

1.3 引物設計與合成

根據GenBank中發表的PEDV S2基因（登錄號：JQ638513.1）和APPV NS3基因（登錄號：MF069133.1）相關序列，選取其保守序列，并通過NCBI進行特異性比對，分別設計了一對特異性引物（表1），由生工生物工程（上海）有限公司合成。

1.4 樣品處理及核酸的提取

將獲得的PEDV和APPV樣品分別編號，將編號的樣品在研磨器中多點取樣，剪碎后加入適量的液氮，研磨成粉末狀后加生理鹽水形成研磨液，-20℃反復凍融3次后備用。采用Trizol法提取病料的總RNA，隨后用反轉錄試劑盒將提取的RNA反轉錄成cDNA。轉錄體系（10μl）為：總RNA 3.0μl，5xPrimescript buffer2.0μl，Primer script RT en-zyme Mix1 0.5μl，Oligo dT Primer 0.5μl，Random 6mers 0.5μl，RNase free dH20 3.5μl。反轉錄的條件是：37℃15min，85℃30s，將轉錄產物置于-20℃保存備用。

以反轉錄得到的cDNA為模板，用所設計的引物對模板進行擴增。擴增體系為（25μl）：總RNA2.0μl，1OxReaction buffer 2.5μl，dNTP Mixl.0μl，Taq Hs 0.5μl，dd H20 18.0μl，上下游引物各0.5μl。反應條件為：95℃4 min;95℃30 s，58℃30s，72℃30s，30個循環：72℃7 min。擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5 目的片段的克隆及測序

將擴增出來的單一條帶用DNA凝膠回收試劑盒回收目的片段，連接pMD19-T載體，轉化到DH5a感受態細胞中。將陽性克隆送到生工生物工程（上海）有限公司測序，并將陽性菌擴大培養后用質粒提取試劑盒提取PEDV、APPV質粒，作為后續試驗的陽性模板。

1.6 雙重RT-PCR的建立

1.6.1 Mg2+、Taq Hs、dNTP Mix用量的優化 在單一PCR的基礎上，分別改變單一變量對PEDV和APPV的混合模板進行檢測。體系為25μl，分別調整Mg2+、Taq Hs、dNTP Mix的用量，選取Mg2+的用量依次為0.5μ1、l.0μl、1.5μ1、2.0μl、2.5μl和3.0μl，選取Taq Hs的用量依次為0.1μl、0.2μ1、0.3μ1、0.4μl、0.5μl和0.6μl，選取dNTP Mix的用量依次為1.0μl、1.5μl、2.0μl、2.5μl、3.0μl和3.5μl。進行雙重RT-PCR擴增，反應程序同方法1.4單一PCR擴增。在保證單一變量的情況下，選取目的條帶效果最好的試劑用量。

1.6.2 引物及退火溫度的優化 在優化Mg2+、TaqHs、dNTP Mix用量的基礎上，單一改變引物用量和退火溫度，其引物用量選取1.0μl、1.5μl、2.0μl和2.5μ1，退火溫度選取50.8℃、51.8℃、53.1℃、58.6℃、59.9℃、61.0℃和61.6℃。用來篩選最適引物用量和退火溫度。

1.6.3 特異性試驗在上述優化的基礎上，用建立的雙重RT-PCR方法對PRRSV、CSFV、RV、PEDV、APPV進行特異性檢測，設立陰性對照，擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.6.4 重復性試驗對APPV和PEDV陽性病料進行抽提，以反轉錄好的cDNA為模板，用建好的雙重RT-PCR方法分別進行批間、批內重復性試驗，已驗證所建立方法的穩定性。

1.6.5 敏感性試驗 用質粒提取試劑盒提取PEDV、APPV質粒，用核酸蛋白儀測定所構建的陽性質粒的質量濃度，計算出模板的拷貝數。在上述優化體系優化后，將模板倍比稀釋進行雙重RT-PCR。

1.6.6 符合性檢測 用本研究建立的雙重RT-PCR方法對四川遂寧、眉山等地采集的病料進行雙重RT-PCR和單- PCR的檢測，并對結果、檢出率和符合率進行對比分析。

2 結果

2.1 Mg2+、Taq Hs、dNTP Mix用量的優化

擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，結果顯示，當Mg2+、Taq Hs、dNTP Mix依次為2.5μ1、0.6μl、1.0μl時，擴增出來的2條條帶最為清晰（圖l、圖2、圖3）。

2.2 引物及退火溫度的優化

優化結果顯示為，當引物用量為lμl（圖4），退火溫度為58.6℃時（圖5），該方法同時擴增出來的APPV和PEDV特異性條帶亮度相對最清晰。

2.3 特異性試驗

用所建立的雙重RT-PCR對PRRSV、CSFV、RV、APPV、PEDV進行檢測，結果（圖6）顯示，PRRSV、CSFV、RV均為陰性，該方法能特異性檢測出APPV和PEDV，證明該方法具有很強的特異性。

2.4 重復性試驗

用所建立的雙重RT-PCR對陽性模板進行批間與批內重復性檢測，結果（圖7）顯示陽性模板所擴增出來的目的條帶完全相同，證明該方法有良好的重復性。

2.5 敏感性試驗

采用建立的雙重RT-PCR的方法和優化的體系對倍比稀釋后的模板進行擴增，結果（圖8）顯示PEDV的最低檢出量為lμl 2.65×l05，APPV的最低檢出量為lμl 3.56x104，證明該方法敏感性較強。

2.6 符合性檢測

對34份采自四川遂寧、眉山等地的疑似病料進行雙重RT-PCR和單一PCR的檢測，結果（表2）顯示檢出PEDV陽性病料14份，單一感染陽性率41.18%。檢出APPV陽性病料4份，單一感染陽性率11.76%。檢出二者混合感染l份，檢出率2.94%。雙重RT-PCR與單一PCR檢測結果進行比較分析，符合率均為100%（表3）。

3 討論

最近幾年，PEDV的感染率越來越高，由于其傳染性強和較短的病程，哺乳仔豬的死亡率可達50%～90%.給養豬業帶來巨大的損失。新生仔豬的免疫系統發育不完全，對其進行PEDV疫苗注射無法誘導產生有效的體液免疫和腸道黏膜的免疫，所以母源抗體對新生仔豬尤為重要。初乳中免疫球蛋白主要為IgG，乳汁中主要為SIgA，乳汁的黏膜免疫對新生仔豬保護力已經被試驗證明。新生仔豬需要足夠的免疫乳汁來抵抗PEDV感染，所以新生仔豬能夠喝到初乳和乳汁尤為重要。先天性震顫是新生仔豬常見的一種現象，會導致新生仔豬全身肌肉震顫，盡管搖動本身并不直接導致死亡，但震顫可以妨礙仔豬發現奶嘴，從而導致仔豬喝不到足夠的初乳和乳汁，嚴重的可導致發育遲緩或死亡。自2010年，新一輪PEDV在全球流行，作者認為，造成PEDV新一輪流行的原因除了PEDV變異株的出現，規模化養殖場疫苗免疫程序不當，現行疫苗無法對其進行有效的保護之外，出生仔豬是否能夠得到母源抗體的保護也是一個很重要的方面。而非典型性瘟病毒恰恰會導致出生仔豬全身震顫，妨礙仔豬發現奶嘴。有報道，中國新生仔豬先天性震顫在規模化豬場發病率約為5%～6% ，在大多數受到新生仔豬先天性震顫影響的豬場中，APPV的發現率在1%～20%。本次試驗建立的雙重RT-PCR方法，通過優化反應體系和試劑用量，可以同時檢測出PEDV、APPV。相較于單一RT-PCR方法更為簡單、省時、省力，同時也節約了檢測試劑的損耗。根據PEDV S2基因和APPV NS3基因的保守序列設計引物，保證了擴增出來的目的片段高度保守，防止了因為病毒的變異而導致試驗結果的假陰性。研究中所設計的2對引物分別能夠擴增出190 bp和500 bp的目的條帶，與設計的引物長度一致，證明了該方法的特異性。對PEDV和APPV的最低檢出量分別為lμl 2.65xl05和1μl 3.56x104，具有較高的靈敏性。對樣品進行符合性檢測，符合率為100%，證明該方法的可行性。相較于單一RT-PCR方法，省時、省力、特異、敏感，對PEDV和APPV混合感染的檢測及流行病學調查具有重要意義。