丁酸通過下調(diào)HMGB1抑制高糖誘導下結(jié)腸上皮細胞NCM460的異常增殖

王思儀　黎潔瑤　于濤　許稷豪　陳其奎　夏忠勝

【摘要】 目的 觀察丁酸對高葡萄糖誘導下結(jié)腸上皮細胞NCM460增殖的影響，探討高遷移率族蛋白1（HMGB1）/晚期糖基化終產(chǎn)物受體（RAGE）通路在其中的作用。方法 用33 mmol/L D-葡萄糖誘導正常人結(jié)腸細胞系NCM460，并予4 mmol/L丁酸干預，通過實時熒光定量PCR、蛋白免疫印跡法、細胞免疫熒光及ELISA檢測細胞HMGB1和RAGE的表達情況。測定增殖細胞核抗原（PCNA）表達量和細胞增殖的情況。過表達及下調(diào)NCM460的HMGB1，觀察HMGB1對細胞表達RAGE及增殖的調(diào)控作用。結(jié)果 高糖誘導下，NCM460細胞增殖能力增高，HMGB1和RAGE的表達升高，細胞上清中HMGB1的含量亦增加（P均<0.001）。過表達HMGB1可上調(diào)RAGE的表達并逆轉(zhuǎn)丁酸對異常增殖的抑制作用，而下調(diào)HMGB1表達可抑制RAGE的表達，抑制異常增殖（P均<0.05）。結(jié)論 高糖誘導下的NCM460存在增殖異常，HMGB1和RAGE表達增加。丁酸通過下調(diào)HMGB1/RAGE通路，抑制高糖誘導下NCM460的異常增殖。

【關(guān)鍵詞】 丁酸；高糖；NCM460細胞；增殖；高遷移率族蛋白B1

【Abstract】 Objective To observe the effect of butyrate on the proliferation of colonic epithelial NCM460 cells induced by high glucose and to explore the role of high-mobility group box 1 protein （HMGB1） /the receptor for advanced glycation end products （RAGE） pathway during this process. Methods The normal human colonic cell lines NCM460 were induced by D-glucose at a dosage of 33 mmol/L and treated with butyrate at a dose of 4 mmol/L. The expression levels of HMGB1 and RAGE in the treated NCM460 cells were quantitatively measured by real-time fluorescent quantitative PCR （RT-qPCR），western blot analysis， immunofluorescent staining. The expression level of proliferating cell nuclear antigen （PCNA） was measured and the cell proliferation was investigated. The level of HMGB1 was over-expressed and down-regulated in NCM460 cells. The effect of HMGB1 upon the expression level of RAGE and the proliferation of NCM460 cells was assessed. Results Under high-glucose induction， the proliferation of NCM460 cells was accelerated， the expression levels of HMGB1 and RAGE were significantly up-regulated and the content of HMGB1 was considerably elevated in the NCM460 cells （all P

【Key words】 Butyrate； High glucose； NCM460 cell； Proliferation； High-mobility group box 1 protein

隨著經(jīng)濟的迅速發(fā)展及人們生活習慣的改變，糖尿病與結(jié)腸癌的發(fā)病率日益升高。大量研究表明糖尿病增加結(jié)腸癌發(fā)生風險，但其機制尚未明確[1]。有研究提示糖尿病狀態(tài)下腸上皮細胞存在異常增殖，這可能與增加結(jié)腸癌的發(fā)病風險相關(guān)[2]。前期研究顯示晚期糖基化終產(chǎn)物受體（RAGE）在糖尿病并發(fā)癥中起著重要作用，RAGE及其配體高遷移率族蛋白B1（HMGBl）可能參與了增加糖尿病患者結(jié)腸癌發(fā)病風險的分子機制[3-5]。有研究表明2型糖尿病患者外周血HMGB1的水平高于非糖尿病人群[6-7]。HMGB1與RAGE 結(jié)合，激活多條細胞信號轉(zhuǎn)導通路，促進CyclinD1基因轉(zhuǎn)錄，加速細胞G期向S期轉(zhuǎn)換，從而促進細胞增殖[8]。丁酸是一種短鏈脂肪酸，糖尿病小鼠腸道菌群豐度分析顯示產(chǎn)丁酸菌明顯下降[9]。有研究表明丁酸可以抑制多種結(jié)腸癌細胞系的增殖[10]。但目前有關(guān)高糖誘導下丁酸對結(jié)腸上皮細胞增殖的影響尚未明確。在本實驗中，筆者擬研究高糖誘導及丁酸處理對結(jié)腸上皮細胞NCM460的增殖、HMGB1和RAGE蛋白表達的影響，探討丁酸對高糖誘導下NCM460異常增殖的調(diào)控作用及機制，為研究糖尿病與結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系提供新思路。

材料與方法

一、細 胞

人正常結(jié)腸上皮細胞株NCM460購自INCell公司；培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)基中（Gibco公司，美國）。在37℃、5% 二氧化碳飽和濕度溫箱中培養(yǎng)，每2 d傳代1次。

二、主要試劑

丁酸（Sigma公司，美國），TotalRNAKit（Invitrogen公司，美國），逆轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒RTreagentkit（Takara公司，日本），BCA蛋白定量試劑盒（Pierce 公司，美國），增強化學發(fā)光法（ECL）試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），單溶液細胞增殖檢測試劑盒 MTS（Sigma公司，美國），人HMGB1的ELISA 試劑盒（北京欣博盛生物科技有限公司）。 β-actin單克隆抗體（Epitomics公司，美國）， HMGB1多克隆抗體（Cell Signaling Technology，美國），RAGE多克隆抗體（Cell Signaling Technology，美國）；增殖細胞核抗原（PCNA）多克隆抗體（Cell Signaling Technology，美國），羊抗兔二抗（KPL公司，美國）。小干擾RNA（siRNA）-HMGB1 和siRNA-NC 陰性對照、過表達pcDNA3.1-HMGB1真核表達質(zhì)粒及其陰性對照pcDNA3.1-NC由蘇州吉瑪基因股份有限公司設(shè)計及合成，LipofectamineTM 2000 購于Invitrogen 公司。

三、方 法

1.細胞培養(yǎng)與分組

復蘇NCM460，培養(yǎng)于RPMI 1640培養(yǎng)基中（含10%胎牛血清），傳代24 h后，于細胞培養(yǎng)基中分別加入藥物干預，并分為5組：5 mmol/L葡萄糖（陰性對照組，NG組），33 mmol/L葡萄糖（高糖組，HG組），33 mmol/L甘露醇（滲透壓對照組，MNG組），5 mmol/L葡萄糖及4 mmol/L丁酸（NG-Bu組），33 mmol/L葡萄糖及4 mmol/L丁酸（HG-Bu組）。每日換液，培養(yǎng)48 h后收集細胞，制成單細胞懸液用于進一步實驗。

2.總RNA的提取及實時熒光定量PCR （QPCR）反應

收集上述各組細胞，用Trizol法提取各組細胞總RNA，測定RNA 濃度及純度后合成cDNA。以cDNA為模板進行QPCR反應。反應結(jié)束后得到各個樣本和內(nèi)參β-actin的Ct值，以目的基因表達的相對定量值（RQ值），即為RNA的相對含量進行統(tǒng)計學分析。PCR引物設(shè)計見表1。

3.蛋白免疫印跡法

細胞裂解：分別收集上述各組加藥干預后的細胞，加入細胞裂解液及蛋白酶抑制劑，于冰上充分裂解細胞30 min，離心后獲取蛋白上清，用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離后，將蛋白電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。PVDF膜在5%脫脂奶粉及室溫環(huán)境下封閉1 h，加一抗于4 ℃過夜，接著加用辣根過氧化酶標記的相應二抗室溫溫育2 h。用ECL法檢測結(jié)合的目的條帶。用圖像分析軟件AlphaImager 2200測定印跡區(qū)帶的光密度。

4.ELISA檢測上清

按說明書檢測細胞培養(yǎng)液中HMGB1的含量。所有樣品設(shè)立復孔，并在同一批次內(nèi)檢測。

5.MTS實驗測定細胞抑制率取對數(shù)生長期的NCM460

細胞密度調(diào)整為1×104/L，接種于96孔板，實驗按分組給予不同的處理后分別繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h 。然后每孔加入10 μl 的MTS溶液，繼續(xù)孵育4 h， 在酶聯(lián)免疫檢測儀以490 nm 波長測定各孔吸光度（A），用吸光度表示細胞的增殖活性。

6.細胞免疫熒光標記

將細胞置于24孔板爬片后，用4%多聚甲醛固定，用磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗3次后，用5%牛血清白蛋白（BSA）封閉，加入相應一抗后于4 ℃孵育過夜。第2日，加入熒光二抗，室溫避光孵1 h，用4，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染細胞核后，放熒光淬滅劑封片，于共聚焦顯微鏡下觀察。

7.細胞轉(zhuǎn)染與分組

將NCM460接種于6孔板中，待細胞密度達到50% ～60%時，根據(jù)LipofectamineTM2000試劑盒說明書用無血清培養(yǎng)基完成轉(zhuǎn)染。分組如下： 轉(zhuǎn)染無關(guān)序列siRNA（siNC組）和干擾組（siHMGB1組），轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pcDNA3.1-HMGB1（plaHMGB1組）及其陰性對照pcDNA3.1-NC（plaNC組），轉(zhuǎn)染6 h后換含血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集細胞進行后續(xù)實驗。

四、統(tǒng)計學處理

采用SPSS 13.0分析數(shù)據(jù)，計量資料用±s表示，2組間比較用t檢驗；多組間比較用方差分析，差異具有統(tǒng)計學意義后再采用LSD-t法行兩兩比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、高糖誘導及丁酸干預對NCM460細胞增殖的影響

MTS法檢測表明，增殖活性在各組間總體比較差異均有統(tǒng)計學意義（F=37.61，P與NG組比較，*為P<0.001；與HG組比較，&為P=0.001

二、高糖誘導下NCM460的HMGB1和RAGE表達增加

各指標各組間總體比較差異均有統(tǒng)計學意義（HMGB1 mRNA的F= 68.17、P<0.001，圖2B、C）。

三、丁酸下調(diào)高糖誘導下NCM460的HMGB1和RAGE的表達

HG-Bu組中HMGB1的mRNA表達量為0.270±0.051，比無丁酸處理的HG組的HMGB1表達量1.024±0.082低（t=7.719，P<0.001，圖3B、C）。

四、高糖誘導及丁酸干預對HMGB1在細胞內(nèi)外表達分布的影響

在NG及MNG組，HMGB1主要在NCM460的胞核表達，細胞質(zhì)呈弱陽性紅色熒光染色（圖4A、B），HG組NCM460胞質(zhì)紅色熒光染色較NG及MNG組強（圖4C）；在高糖誘導同時加入丁酸干預32 h后NCM460胞質(zhì)的熒光染色較未予丁酸處理弱（圖4D），42 h后NCM460胞質(zhì)的熒光染色進一步減弱（圖4E）。

五、高糖誘導及丁酸干預對細胞培養(yǎng)上清中HMGB1水平的影響

HMGB1水平在各組間總體比較差異均有統(tǒng)計學意義（F= 31.79，P與NG組比較， *為P<0.05；與HG組比較，&為P<0.05

六、HMGB1調(diào)控RAGE的表達及NCM460的細胞增殖

siRNA轉(zhuǎn)染后，siHMGB1組的HMGB1的mRNA及蛋白表達水平分別為0.246±0.030及（0.147±0.026）ng/ml，較siNC組的1.054±0.060及（0.573±0.050）ng/ml低（分別為t=12.080、P<0.001，圖6D～F）。以上結(jié)果表明siRNA有效干擾了NCM460表達HMGB1，而HMGB1重組質(zhì)粒有效上調(diào)NCM460中HMGB1的表達。

進一步觀察調(diào)控HMGB1表達后，細胞RAGE表達及細胞增殖的改變情況，結(jié)果顯示，與siNC組的RAGE表達量1.158±0.080和PCNA表達量0.914±0.070相比，siHMGB1組的0.748±0.069和0.644±0.073均較低（分別為t=3.894、P=0.005，t=2.669、P=0.028，圖6G、H）。

除了高糖誘導外，還同時用丁酸干預plaNC組和plaHMGB1組（高糖誘導無丁酸處理為對照），各指標各組間總體比較差異均有統(tǒng)計學意義（RAGE的F=9.507、P=0.003，PCNA的F=10.880、P=0.002），其中plaNC組的RAGE和PCNA的蛋白表達水平（0.632±0.062）ng/ml及（0.618±0.060）ng/ml較對照組的（1.189±0.123）ng/ml及（0.942±0.065）ng/ml低（RAGE的LSD-t= 3.417、P=0.007，PCNA的LSD-t= 3.232、P=0.007，圖6I～K）。而HMGB1上調(diào)后的plaHMGB1組，其細胞RAGE和PCNA的的蛋白表達水平（1.295±0.145）ng/ml及（1.067±0.083）ng/ml與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義（RAGE的LSD-t= 0.650、P=0.529，PCNA的LSD-t= 1.253、P=0.235，圖6I～K）。說明上調(diào)NCM460的HMGB1表達水平后，丁酸對高糖誘導下表達增加的RAGE蛋白及細胞異常增殖的抑制作用減弱。

討 論

探討丁酸是否可以改善高糖誘導下結(jié)腸上皮細胞的異常增殖，可以為降低糖尿病患者的結(jié)腸癌發(fā)病率提供新思路。在本實驗中，筆者證明了丁酸通過下調(diào)HMGB1和RAGE來抑制高糖誘導下結(jié)腸上皮細胞的異常增殖，提示丁酸及其下游分子HMGB1在糖尿病結(jié)直腸癌的預防控制中可能是至關(guān)重要的。

在本研究中，加入高糖培養(yǎng)基后的NCM460細胞增殖能力增強（圖1）；同時，NCM460的HMGB1和RAGE表達量升高（圖2）。在高糖誘導下的NCM460的細胞質(zhì)和細胞培養(yǎng)上清中，HMGB1的表達均升高（圖4、5）。有研究表明，在核內(nèi)表達的HMGB1可以從細胞核釋放到細胞質(zhì)中，進一步分泌至細胞外基質(zhì)作為信號分子發(fā)揮功能[11-13]。本研究顯示高糖誘導下NCM460內(nèi)存在HMGB1的易位，可能與其參與高糖誘導下NCM460細胞的異常增殖的相關(guān)機制有關(guān)。

進一步行過表達及抑制表達HMGB1的研究，結(jié)果顯示，NCM460細胞增殖能力與HMGB1和RAGE表達水平相一致（圖6），提示HMGB1和RAGE可影響NCM460的細胞增殖。這些結(jié)果表明高糖可能刺激HMGB1和RAGE的表達，同時促使HMGB1從細胞核分泌到細胞質(zhì)、細胞外基質(zhì)與RAGE結(jié)合， 而HMGB1和RAGE的結(jié)合可能引起

A～C：轉(zhuǎn)染后，HMGB1的mRNA和蛋白表達水平下調(diào)，與另一組比較，*為P腸上皮細胞的異常增殖。根據(jù)以往的研究結(jié)果，Wnt信號通路在調(diào)節(jié)正常的腸上皮細胞增殖中起關(guān)鍵作用[14]。有研究者揭示了HMGB1/RAGE通路能調(diào)節(jié)肝癌細胞增殖[15]。本研究結(jié)果顯示高糖誘導下結(jié)腸上皮細胞的異常增殖與HMGB1和RAGE升高有關(guān)。

丁酸可通過抑制HMGB1蛋白減弱心肌缺血時的肺損傷或炎癥反應，但其中機制尚未明確[16-17]。本研究顯示丁酸可以下調(diào)高糖誘導下NCM460的HMGB1和RAGE的表達，同時降低高糖誘導下HMGB1在細胞質(zhì)及細胞培養(yǎng)上清的表達，并且抑制NCM460細胞的異常增殖。這提示丁酸可能通過抑制HMGB1的表達而抑制高糖誘導下腸上皮細胞的異常增殖。另外，本研究顯示丁酸只有在高糖誘導下才抑制NCM460細胞的增殖，而不影響正常狀態(tài)下的細胞增殖。丁酸如何影響細胞增殖的相關(guān)機制是復雜的。有研究顯示，丁酸涉及許多復雜的分子機制[18-19]。根據(jù)本研究與以往的研究結(jié)果，筆者推測丁酸可能對正常腸上皮細胞和高糖誘導下腸上皮細胞的增殖調(diào)控具有不同的作用。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，高糖誘導下NCM460的HMGB1和RAGE蛋白的表達增加，且與異常的增殖相關(guān)，而丁酸可以抑制HMGB1的表達，進而改善NMC460的異常增殖，這為研究糖尿病結(jié)腸癌的發(fā)生提供了新思路。但丁酸調(diào)控腸上皮細胞增殖可能還通過其它信號轉(zhuǎn)導通路實現(xiàn)， 其完整的分子機制與涉及的信號通路還有待于進一步研究。

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（收稿日期：2018-01-22）

（本文編輯：洪悅民）