葉面噴施鉀肥對霞脆桃果實品質及KUP基因表達的影響

宋志忠 許建蘭 張斌斌 俞明亮 馬瑞娟

摘要：以霞脆桃為材料，研究了葉面噴施鉀肥對果實品質的影響及果實發育中K+動態平衡與KUP家族基因表達水平之間的聯系。結果表明：噴施鉀肥顯著增加了霞脆桃的鮮質量和體積大小，改善了果皮著色指標，提高了果實可溶性固形物和可溶性糖含量，有效提升了桃果實品質，并有效增強了果實發育不同時期果肉的鉀素營養狀況;桃KT/HAK/KUP家族基因在桃果實發育不同時期的表達水平存在差異，Ppe KUP1基因在霞脆桃整個果實發育期的表達水平最高，其次是PpeKUP5和PpeKUP3，而PpeKUP14～PpeKUP16在果實發育不同時期均沒有檢測到表達量;PpeKUP1、Ppe KUP2和PpeK UP7在轉錄水平上對噴施鉀肥處理最為敏感，其表達水平與對照相比，在第2次果實膨大期（75 DAFB）至達到商業成熟度時（95 DAFB）均顯著增強。

關鍵詞：桃;果實發育;鉀肥;葉面噴施;KT/HAK/KUP家族;基因表達

中圖分類號：S662.1

文獻標識碼：A

文章編號： 1000-4440（2018） 05-1107-06

鉀是植物細胞中含量最為豐富的金屬元素之一，在維持細胞電荷平衡，調節細胞膨壓，參與光合作用和蒸騰作用等多種生命過程中起重要作用，是植物正常生長發育必需的營養元素。土壤缺鉀影響植物光合作用與葉綠素合成，缺鉀嚴重將引起植物組織萎縮。果園中，鉀肥施用與花的開放、桃果實品質、產量及果實采后貯藏品質密切相關。缺鉀土壤中施用適量鉀肥，能顯著提高果實可溶性固形物含量，改善糖酸比，提升果實內在品質，并能增加果實單果質量，改善著色指數以及果頂形狀，提高果實外觀品質。此外，施用鉀肥可顯著改善果實的抗裂果特性和貯藏運輸特性。然而，諸多研究主要集中在生理生化層面，鉀素營養與果樹生長及果實發育過程中K+吸收與轉運的分子機制研究報道鮮少。

KT/HAK/KUP家族基因編碼高親和的K+轉運體蛋白，介導植物對K+的吸收、轉運和分配，維持植物體內鉀素營養平衡。然而，該家族成員的功能尚未完全清楚，個別基因的研究多見于模式植物擬南芥。吸收動力學研究結果表明擬南芥AtK UP1介導根部細胞吸收外界K+，既具有低親和吸附系統（IAS）的特征，又具有高親和吸附系統（HAS）的特征。表觀遺傳學研究結果表明AtKUP2、AtKUP4和AtHAK5主要控制根毛區延長和細胞擴張，介導根部吸收的K+向地上部轉運或分配;AtKUP7介導根部K+的吸收并將吸收的K+運輸到木質部，特別是缺鉀條件下，其將K+從根部向地上部的轉運作用更顯著。借助生物信息學分析方法，宋志忠等從葡萄和桃中分別鑒定出18和16個KUP基因成員。然而，多年生木本植物（尤其是果樹作物）KT/HA K/K UP家族成員的功能依然未知。

桃[Prunus persica（L.）Batsch]是一種全球重要的水果，隨著基因組序列的公布，迅速成為最具研究潛力的園藝作物之一。本研究分析了鉀肥施用對霞脆桃生長指標及果實品質的影響，并通過實時熒光定量PCR分析了果實發育中K+動態平衡與KUP家族基因表達水平之間的聯系，從分子層面探討鉀肥施用、鉀素營養狀況與果實發育及品質之間的密切關系，為果樹施用鉀肥提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及取樣

供試材料為江蘇省農業科學院桃試驗園中的7年生早中熟桃品種霞脆，試驗于2015和2016年重復開展，重復性驗證一致，本文展示數據源自2015年試驗。鉀肥施用處理參照宋志忠等和李靖等報道的方法。選擇同一田地的2行桃樹（各6棵，行株距為5mx3m），其中一行為對照，另一排行進行葉片噴施處理。盛花后45d（5月上旬），即桃幼果已成形并將進入第1次快速膨大期，對選定的桃樹噴施3%（本研究室前期鉀肥預試驗所得的最佳噴施量）的KH2P04溶液，以滴液為度，試驗植株按常規栽培措施管理。果實樣品采集：從盛花后35d（4月下旬，30DAFB）起，每隔20d取一次樣，至果實達到商業成熟度時（6月底，95 DAFB），共采樣4次，用于基因表達分析，達到商業成熟度的果實用于果實品質的各項指標測定。

1.2 桃果實生理指標測定

用分析天平測定果實單果質量，并用游標卡尺測定果實的縱徑、橫徑和側徑。在果實縫合線兩側中部用TA.XT.Plus型質構儀測定帶皮果肉硬度，探頭直徑8mm，測試深度5mm，貫人速度lmm/s。

參照馬瑞娟等的方法，用Color Quest XE色差計測定果實顏色指標。其中L4表示顏色的亮度，取值范圍為[1，100];α*、b*表示顏色組分，取值范圍為，α*值為紅綠色差指標，b*值為黃藍色差指標。a*/b*值反映果實的真實色澤，負值時果實為綠色，零值時表示果實顏色由綠色轉為黃色或橙紅色，正值時表示果實色澤為黃色或橙紅色。

果實硬度測定完成后，取測定硬度的2個點處果肉的汁液用便攜數顯折光儀PAL-1測定果實的可溶性固形物含量，取2個點的平均值作為每個果實的實際可溶性固形物含量。果肉勻漿后以702 SM Titrino自動電位滴定儀測定可滴定酸含量，用斐林試劑滴定法測定可溶性糖含量。

鉀離子含量測定參照Song等的方法：樣品在105℃中殺青30min.并在65℃烘箱烘烤48h，均勻粉碎后用HNO3-HC104消化過夜，并通過石墨高溫消解儀消煮4.5h，定容后用電感耦合等離子體原子發射光譜儀（ICP-AES）測定。

1.3 果肉總RNA的提取和熒光定量PCR

利用MiniBEST Plant RNA Extraction Kit（TaKa-Ra公司產品）提取果實樣品的總RNA，并通過Pri—meScriptTM RT reagent Kit反轉錄試劑盒（TaKaRa公司產品）合成第一鏈cDNA作為模板，用于實時熒光定量PCR。通過NCBI/Primer-BLAST在線服務器設計桃PpeKUP基因的特異性表達引物，分別以桃Ubiquitin，基因（GenBank No.KJ598788）和Actin，基因（GenBank No.KP690196）為內參，所用引物序列參照Song等的報道，通過ABI 7500實時熒光定量PCR儀檢測桃PpeKUP基因在桃花不同開放時期的表達特征。熒光染料為SYBR Green（TaKaRa公司產品），反應體系參照商品說明書。反應程序為：95℃預變性30s：95℃變性5s，58℃退火34s（40個循環）;最后72℃延伸10s。

1.4 數據分析

所有數據通過SPSS 13.0軟件進行顯著性分析，在鉀肥處理與對照2個獨立桃果實樣品間進行￡檢驗（P<0.05為顯著水平，P<0.01為極顯著水平）。

2 結果與分析

2.1 噴施鉀肥對桃果實外觀的影響

桃果實鮮質量隨果實的發育而逐漸積累（表1），在盛花后75d（6月上旬，75DAFB）出現第2次果實膨脹期，在達到商業成熟度時（6月底，95DAFB），霞脆桃平均單果質量達到最高（157.76g）。噴施KH2PO4鉀肥顯著提高了不同發育時期的桃果實單果質量，在經濟采收期（95DAFB）達到了178.42g，即顯著提高了15%（表1和圖1）。

桃果實體積隨著果實的發育而逐漸增加，在經濟采收期，霞脆桃果實的平均縱徑、橫徑和側徑分別達到最大值（表1）。與對照相比，噴施鉀肥顯著提高了不同檢測時期平均縱徑和側徑的長度（P<0.05），在經濟采收期（95 DAFB）縱徑和側徑分別提高了11.36%和12.65%，而橫徑沒有顯著變化（表1和圖1）。

霞脆屬于易著色桃品種，在桃果實發育和成熟過程中，果皮顏色由綠色逐漸轉為紅色。在達到商業成熟度時（95 DAFB），桃果實α*和α*/b*達到峰值。與對照相比，噴施KH2PO4鉀肥顯著增強了桃果實的α*和α*/b*，分別提高了20.97%和15.20%.而對桃果實L*值沒有顯著影響（表2），說明噴施鉀肥可能通過提高果實的α*和α*/b*值改善果皮色澤和外觀。

2.2 噴施鉀肥對桃果實品質的影響

果實硬度、可溶性固形物含量、可溶性糖含量和可滴定酸含量等都是影響果實內在品質的重要指標。在達到商業成熟度時（95 DAFB），噴施鉀肥的桃果實可溶性固形物和可溶性糖含量相比于對照分別提高了15.81%和15.20%，而果實硬度和可滴定酸含量沒有顯著差異（表3）。

霞脆桃果實發育不同時期果肉中K+含量存在差異，隨著桃果實的不斷發育而逐漸增加，在第2次果實膨大期（75 DAFB）至達到商業成熟度時（95DAFB），K+含量達到峰值（表4）。在盛花后55d、75d和95d，噴施鉀肥的果肉K+含量與對照相比分別上升20.26%、16.51%和21.00%。

2.3 桃果實發育過程中KT/HAK/KUP家族基因的表達特征

在前期研究中，筆者從桃基因組中鑒定并克隆了16個KUP家族基因。熒光定量PCR分析結果表明：PpeKUPl～PpeKUP13基因在霞脆果實中均能檢測到，且表達水平差異較大，其中，PpeKUPI基因的表達水平最高，其次是PpeKUP5和PpeKUP3，其他基因的表達量相對較低，而PpeKUP14～Ppe-KUP16基因在霞脆果實中沒有檢測到表達量（圖2）。此外，PpeKUPl～PpeKUP13基因在試驗的4個不同時期的表達趨勢類似，均在第1次果實膨大期（35DAFB）和硬核期（55DAFB）的表達水平較高，并隨著果實的不斷發育和成熟而逐漸降低。其中，PpeKUP1基因在硬核期（55DAFB）最為突出，其表達水平約為其他PpeKUP基因的5—20倍，說明其在果實發育初期是尤為重要的鉀離子轉運體（圖2）。

2.4桃果實發育過程KT/HAK/KUP家族基因對噴施鉀肥的響應

熒光定量PCR結果表明，PpeKUP1、PpeKUP2和PpeKUP7在轉錄水平對噴施鉀肥處理較為敏感，PpeKUI的表達水平在噴施鉀肥后的3次不同檢測點均顯著上升，而PpeKUP2和PpeKUP7的表達水平在第2次果實膨大期（75DAFB）至達到商業成熟度時均顯著增強（圖3），其他基因在轉錄水平上的表達水平不受噴施鉀肥影響。

3 討論

K+是植物細胞中含量最為豐富的陽離子之一，鉀是植物正常生長和發育必不可缺的品質元素，與花的開放、果實發育、品質形成及產量密切相關。本研究從生理層面分析了噴施鉀肥對霞脆桃果實品質的影響，結果表明噴施鉀肥顯著提高了霞脆桃果實鮮質量和果實大小，改善了果皮著色指標，并提高了果實可溶性固形物和可溶性糖的含量，提升了果實內在品質。這些結果與鉀肥施放改善番茄、蘋果、檸檬、獼猴桃、龍眼、蟠桃、油桃和普通桃等果實品質的諸多報道是一致的。而且噴施鉀肥有效改善了桃果實發育不同時期果肉的鉀素營養狀況，推測鉀素營養狀況的改善，促進了果實縱徑和側徑發育，可能是桃果實鮮質量增加的直接因素，也可能是桃果實品質得以改善的因素之一。

果樹研究中，有關鉀肥控釋促進果實發育及其鉀素營養的分子基礎研究鮮少。本研究從轉錄水平分析桃鉀轉運體KT/HAK/KUP家族基因在霞脆桃果實發育不同時期的表達特征及其對噴施鉀肥的差異響應。結果表明，KT/HA K/KUP家族基因在果實發育與成熟不同時期的表達水平差異明顯，均在第1次果實膨大期（35DAFB）和硬核期（55DAFB）的表達水平較高，表明在桃幼果形成和硬核形成時期需要更多的KUP轉運體發揮作用，以便富集較多的K+參與果實發育初期細胞內各種依賴K+的生理過程，也可能為第2次果實膨大（75 DAFB）和果實成熟儲備充足的K+驅動力。伴隨著桃果實的不斷發育和成熟，KT/HAK/KUP家族基因的表達水平逐漸降低，說明桃果實發育成熟后這些轉運體的功能下降。桃果實發育成熟后，體內K+有可能向其他組織（例如一年生枝條的韌皮部或樹干）轉移，但依然維持在較高的鉀素營養狀態，維持并保障采收后果實的基本形態和鮮質量。

Song等研究結果表明PpeKUPI基因在桃幼苗的根、莖和葉中均有表達，且在根部易受外界非生物脅迫的調控。宋志忠等發現PpeKUPL基因在桃花中的表達量相對較低，遠低于該家族其他成員基因。本研究結果表明PpeKUP1基因在霞脆桃果實發育初期至硬核期（55 DAFB）的表達量極高，約為其他PpeKUP基因表達水平的5～20倍，且在轉錄水平上對噴施鉀肥非常敏感，其表達水平從硬核期（55DAFB）至達到商業成熟度時（95DAFB）是持續被誘導的，提示PpeKUPl是果實發育過程中（特別是幼果形成及發育初期）重要的鉀離子轉運體，在維持果肉鉀素營養方面發揮較大作用。盡管Ppe-KUP5基因是桃幼苗（特別是根部）KT/HA K/KUP家族基因中表達量最高的，但在桃花中的表達量是極低的。本研究中，PpeKUP5在桃果實發育中的表達水平僅次于PpeKUPI，且在霞脆桃果實發育早期（35～55DAFB）的表達量較高，但對噴施鉀肥不敏感。雖然PpeKUP7基因在桃幼苗和桃花中表達量相對較低，在霞脆桃果實中表達量也是極低的，但對噴施鉀肥較為敏感，在第2次果實膨大期（75DAFB）至達到商業成熟度時（95DAFB）其表達均顯著增強，表明其與PpeKUOI和PpeKUP5在桃果實發育與成熟過程中，是響應和增強果肉鉀素營養狀態所不可或缺的。同時，在果實發育成形并不斷成熟時，一年生枝條韌皮部和樹葉也逐漸生長和發育，這3個轉運體基因也有可能在將果實內K+向一年生枝條韌皮部、樹葉或樹干的轉移和分配中發揮一定的作用。此外，PpeKUP14～PpeKUP16基因在幼苗根、莖和葉中均有表達（低于PpeKUP5），但在桃花開放后不同時期均不表達，PpeKUP14～PpeKUP16在霞脆桃果實發育不同時期亦檢測不到，且對外界鉀肥施用沒有響應，充分表明這3個轉運體可能在桃花開放和果實形成及發育過程中不發揮作用，而可能參與其他生命過程。