不同濃度的石榴皮多酚軟膏對兔耳粉刺模型組織病理形態(tài)學(xué)的影響

胡彬 楊逸璇 楊婉婷 王峰 陶夢穎 朱明芳

〔摘要〕 目的 觀察不同濃度的石榴皮多酚軟膏對兔耳粉刺模型組織病理形態(tài)學(xué)的影響，確定痤瘡治療的最佳石榴皮多酚軟膏濃度。方法 采用家兔左、右外耳道外緣處約2.0 cm×2.0 cm范圍涂抹2%煤焦油溶液約0.5 mL，1次/d，連續(xù)2周以制成動物粉刺模型。將不同濃度（18%、9%、3%）的石榴皮多酚制備成軟膏，均勻涂抹于兔耳粉刺模型，2次/d，連續(xù)4周。取材后在光鏡下觀察兔耳粉刺模型組織病理形態(tài)的變化。結(jié)果 石榴皮多酚中劑量組與陽性藥物（異維A酸）組對粉刺模型病理組織形態(tài)學(xué)兔耳炎癥程度、角化程度、毛囊擴張程度的影響最為顯著；模型組與空白組相比，兔耳炎癥、角化、毛囊擴張顯著（P<0.01）；與模型組相比，石榴皮多酚中劑量組與陽性藥物組均能顯著降低兔耳炎癥程度、角化程度、毛囊擴張程度（P<0.01）；石榴皮多酚高劑量組與石榴皮多酚低劑量組也能降低兔耳兔耳炎癥程度、角化程度、毛囊擴張程度（P<0.05），但不如石榴皮多酚中劑量組與陽性藥物組（P<0.05）。結(jié)論 石榴皮多酚中劑量組及陽性藥物組對兔耳粉刺模型的抗角化及抗炎作用最顯著。

〔關(guān)鍵詞〕 石榴皮多酚軟膏；抗角化；粉刺；組織病理學(xué)

〔中圖分類號〕R285.5；R758.73+3 〔文獻標(biāo)志碼〕A 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2018.04.008

〔Abstract〕 Objective To observe the different concentration of pomegranate peel polyphenols ointment on histopathologic morphology in rabbit ear acne model， and to determine the best concentration of pomegranate peel polyphenols ointment on acne. Methods The 2% coal tar daub solution about 0.5 mL was smeared at about 2.0 cm x 2.0 cm range of rabbit left and right outer edge， once daily for two weeks to make rabbit ear acne model. The different concentration （18%， 9%， 3%） of pomegranate peel polyphenols ointment was prepared， which was smeared evenly on the rabbit ear acne model， twice daily for four weeks. The histopathologic changes were observed under light microscopy. Results The medium dose of pomegranate peel polyphenols group and the control group （isotretinoin） showed the most obvious effect on the pathological histology of acne model in the degree of inflammation， keratinization， hair follicles expansion. Compared with blank group， the degree of inflammation， keratinization， hair follicles expansion of model group was more significant （P<0.01）. Compared with the model group， the medium dose of pomegranate peel polyphenols group and the control group could significantly decrease the degree of inflammation， keratinization， hair follicles expansion （P<0.01）； the low dose and high dose of pomegranate peel polyphenols groups also could obviously decrease the degree of inflammation， keratinization， hair follicles expansion （P<0.05）， the decreased degree in which was lower than medium dose of pomegranate peel polyphenols group and the control group （P<0.05）. Conclusion The medium dose of pomegranate peel polyphenols group and the control group show the most significant anti-keratinization and anti-inflammatory effect on the rabbit ear acne model.

〔Keywords〕 pomegranate peel polyphenols ointment； anti-keratinization； acne； histopathology

痤瘡（acne）是一種發(fā)生在青少年和成人中常見的毛囊皮脂腺的慢性炎癥性皮膚病，好發(fā)于顏面及胸背部皮脂腺，形成毛囊性丘疹、結(jié)節(jié)、膿皰、囊腫、瘢痕等[1]。目前，西醫(yī)治療痤瘡的主要藥物包括維甲酸類藥物、抗生素類、抗雄激素和雌性激素類藥物、糖皮質(zhì)激素、鋅制劑等[2-5]，以上治療雖可使癥狀明顯減輕，但還是出現(xiàn)諸多問題，如癥狀易反復(fù)、副作用大、療程長、耐藥性及致畸性等，例如異維A酸[6]在臨床使用中可發(fā)生唇炎、眼干、鼻黏膜干燥等皮膚黏膜反應(yīng)[7-9]。由此可見，西藥的不良反應(yīng)及副作用大大降低了患者的依從性，從而使臨床應(yīng)用局限[10]。近年來，中醫(yī)藥治療痤瘡，療效明顯，且劑型多樣，副作用小，來源豐富，很受患者的青睞。因此，中藥制劑治療痤瘡的研究已成為皮膚科研究中的熱點，導(dǎo)師朱明芳臨床應(yīng)用發(fā)現(xiàn)無論是內(nèi)服還是外用石榴皮治療痤瘡都有較好療效，而以石榴皮為主的多種中藥打粉制成面膜療效尤為顯著，經(jīng)前期研究得出石榴皮中石榴皮多酚起著決定性的作用[11]。因此，本研究觀察了不同濃度石榴皮多酚軟膏對痤瘡治療的療效，并確定最佳濃度。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級新西蘭大耳白兔42只，雌雄各半，體質(zhì)量（2.5±0.5） kg，湖南中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供，每只分籠圈養(yǎng)于動物中心實驗室兔豚鼠實驗室。飼養(yǎng)溫度20～25 ℃，濕度50%～70%。

1.2 主要試劑

煤焦油（上海源葉生物科技有限公司），0.025%維A酸乳膏（重慶華邦制藥股份有限公司），自制高、中、低濃度石榴皮多酚軟膏[按處方量分別稱取十二烷基硫酸鈉0.250～0.375 g、甘油10 g、白凡士林4.5 g、十八醇5 g、單硬脂酸甘油酯 5 g、液體石蠟 3 g、硬脂酸2.5～3.5 g、月桂氮酮1.2～1.8 g，水適量，總量至100 g。水油兩相分別水浴加熱至70～80 ℃，攪拌至熔融。將水相以細流狀緩緩加入油相中，70～80 ℃水浴下持續(xù)攪拌10 min，室溫下繼續(xù)攪拌至冷凝，得水包油（O/W）型軟膏基質(zhì)]。無水乙醇、0.9%氯化鈉注射液、10%水合氯醛、4%多聚甲醛，均為谷歌生物（長沙）生物科技有限公司提供。

1.3 主要儀器

ES-1000E 型電子天平（湖南長沙湘平科技發(fā)展有限公司）；Sigma1-15K高速冷凍離心機（德國Sigma公司）；雙目倒置顯微鏡（OLYMPUS公司）；3 mm直徑打孔器等。

1.4 動物造模[12]

將新西蘭大耳兔在適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，于第2周開始在左、右外耳道外緣處約2.0 cm×2.0 cm范圍涂抹2%煤焦油溶液約0.5 mL，1次/d（煤焦油臨時用95%酒精配制成2%的煤焦油溶液），連續(xù)2周以制成動物粉刺模型。

1.5 實驗分組與干預(yù)

42只兔隨機分為7組，為空白組、模型組、基質(zhì)組、陽性組、低劑量組、中劑量組、高劑量組。空白組正常飼養(yǎng)，其余6組均于第2周給予造模處理，造模成功后于第4周開始干預(yù)，空白組和模型組給予0.1 mL生理鹽水涂抹兩耳；基質(zhì)組每日在兔耳角化處涂0.1 g的基質(zhì)（不含石榴皮多酚）；高劑量、中劑量、低劑量組每日于左右角化處分別涂0.1 g的濃度為18%、9%、3%的石榴皮多酚軟膏（90%石榴皮多酚購自陜西騰邁生物科技有限公司，軟膏基質(zhì)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院自制）。陽性組每天于左右耳角化處涂0.025%維A酸乳膏0.1 g。每天涂2次，連續(xù)3周，給藥部位均為兔耳造模處。

在第42天，即末次給藥24 h后取材，取材時烏拉坦耳緣靜脈緩慢注射麻醉，待動物進入麻醉狀態(tài)后，用3 mm直徑打孔器制備左右耳涂煤焦油處的4個耳片，用10%的福爾馬林固定，石蠟包埋，切片，HE染色，于光鏡下觀察組織變化，拍照，測量。

1.6 指標(biāo)測定

光鏡下觀察各組組織病理學(xué)表現(xiàn)，主要集中在炎性細胞浸潤、角質(zhì)層厚度、皮脂腺大小、毛囊擴張程度等方面。光鏡下隨機選5個高倍視野測量角質(zhì)層厚度、皮脂腺長短徑、炎性細胞浸潤程度、毛囊擴張程度。按以下標(biāo)準進行評分和分級[13]。炎性細胞評分與分級標(biāo)準，正常：無炎性細胞浸潤；輕度：局部性炎細胞浸潤，細胞散在（1分）；中度：局灶性炎細胞浸潤，細胞較密集，或出現(xiàn)多個浸潤灶（2分）；重度：彌漫性炎細胞浸潤（3分）。毛囊擴張程度評分與分級標(biāo)準，正常：與空白組相同（0分）；輕度：角化物質(zhì)增多，但不致密，且為未充滿毛囊（l分）；中度：角化物質(zhì)致密，但為充滿毛囊；或角化物質(zhì)不致密，但充滿毛囊（2分）；重度：角化物質(zhì)致密，充滿毛囊（3分）。

1.7 統(tǒng)計方法

統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件。計量資料進行正態(tài)性檢驗。符合正態(tài)分布者，采用單因素方差分析，方差齊者采用LSD法，方差不齊采用非參數(shù)檢驗。計數(shù)資料采用卡方檢驗進行描述統(tǒng)計，用卡方檢驗進行數(shù)據(jù)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度石榴皮多酚軟膏對粉刺模型兔耳組織病理學(xué)的影響

空白組兔耳皮膚上皮結(jié)構(gòu)完整，細胞無水腫，排列整齊，深層毛囊、皮脂腺、汗腺組織無炎癥細胞浸潤，毛囊壁無反應(yīng)性增生等情況。模型組兔耳皮膚上皮明顯充血腫脹，細胞結(jié)構(gòu)不完整，排列欠連續(xù)；表皮下角質(zhì)層結(jié)構(gòu)排列不規(guī)則，局部出現(xiàn)增生增厚；深層毛囊、皮脂腺、汗腺組織有大量炎癥細胞浸潤，毛囊壁反應(yīng)性增生增厚嚴重，毛囊內(nèi)出現(xiàn)大量組織沉積物，皮脂腺結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)反應(yīng)性增大，角質(zhì)化嚴重；血管內(nèi)皮出現(xiàn)細胞腫脹，充血，有反應(yīng)性增生；耳廓間質(zhì)纖維組織有纖維化傾向，有大量單核細胞、中性粒細胞浸潤，出現(xiàn)急慢性炎癥改變。基質(zhì)組在角質(zhì)化及毛囊增生、炎癥反應(yīng)方面與模型組表現(xiàn)類似。低劑量組、高劑量組兔耳皮膚組織病理學(xué)觀察與模型組有一定的區(qū)別，炎癥程度、毛囊增生程度等較模型組減輕，呈現(xiàn)一定的治療作用。中劑量組、陽性藥物組從組織病理染色結(jié)果來看療效比較顯著，主要體現(xiàn)在減輕角質(zhì)化程度、局部組織充血、炎性程度等方面。見圖1。

2.2 不同濃度石榴皮多酚軟膏對粉刺模型兔耳炎性細胞浸潤程度的影響

各組大鼠炎性細胞浸潤程度分級及評分結(jié)果見表1，在炎性細胞浸潤程度分級上模型組與空白組經(jīng)卡方檢驗，2=22，P<0.001，而炎性細胞浸潤評分模型組也顯著高于空白組，P<0.01，說明粉刺模型局部出現(xiàn)較強的炎癥反應(yīng)；基質(zhì)組與模型組的炎性細胞浸潤程度經(jīng)卡方檢驗，x2=1.725，P=0.422，且在炎性評分上經(jīng)統(tǒng)計學(xué)比較兩者無顯著性差異（P>0.05）；低劑量組與模型組在炎性細胞浸潤程度上經(jīng)卡方檢驗，x2=11.511，P=0.009，而局部組織炎性評分相比也顯示出統(tǒng)計學(xué)差異P<0.05；中劑量組與模型組的比較時發(fā)現(xiàn)中劑量組能顯著改善兔耳炎性等級，經(jīng)卡方檢驗x2=9.455，P=0.024，且對炎性評分的兩兩比較時發(fā)現(xiàn)P<0.01，差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義；高劑量組與模型組炎性程度相比經(jīng)卡方檢驗x2=9.055，P=0.029，炎性評分比較P<0.05；陽性藥物炎性細胞浸潤程度分級及評分的組間比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與模型組經(jīng)卡方檢驗x2=12.067，P=0.007，炎性評分比較P<0.01。從表中可知，在對兔耳炎性細胞浸潤程度的影響上，中劑量組與陽性藥物組作用相當(dāng)，均有較強的治療作用，低劑量組與高劑量組也存在治療作用，但效果不如中劑量組與陽性藥物組。

2.3 不同濃度石榴皮多酚軟膏對粉刺模型兔耳角質(zhì)層厚度及皮脂腺大小的影響

不同濃度石榴皮多酚軟膏對粉刺模型兔耳均存在一定的影響，但各組之間差異明顯，模型組與空白組比較皮膚角質(zhì)層厚度、皮脂腺長短徑出現(xiàn)明顯增厚、增長，差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），說明粉刺模型兔耳皮膚角質(zhì)化明顯，皮脂腺出現(xiàn)明顯增生。基質(zhì)組與模型組比較差異并不明顯，角質(zhì)層厚度及皮脂腺長短徑經(jīng)統(tǒng)計學(xué)比較（P>0.05），說明石榴皮多酚基質(zhì)物質(zhì)對粉刺兔耳皮膚角質(zhì)化、皮脂腺增生沒有影響。低劑量組、高劑量組與模型組比較皮膚角質(zhì)層厚度、皮脂腺長短徑明顯降低（P<0.05），但與空白組、中劑量組和陽性藥物組比較明顯增厚（P<0.05），說明高、低劑量的石榴皮多酚軟膏對粉刺模型兔耳皮膚角質(zhì)層厚度有一定的改善作用，但作用一般。而中劑量組、陽性藥物與模型組比較，其皮膚角質(zhì)層厚度、皮脂腺長短徑要顯著低于模型組（P<0.01），說明中劑量石榴皮多酚軟膏在降低皮膚角質(zhì)層厚度上作用明確，與陽性藥物作用相當(dāng)。見表2。

2.4 不同濃度石榴皮多酚軟膏對粉刺模型兔耳毛囊擴張程度的影響

各組大鼠毛囊擴張程度分級及評分結(jié)果如表3，在毛囊擴張程度分級上模型組與空白組經(jīng)卡方檢驗，x2=21.8，P<0.001，而毛囊擴張程度評分模型組也顯著高于空白組（P<0.01），說明粉刺模型局部毛囊擴張明顯；基質(zhì)組與模型組的毛囊擴張程度經(jīng)卡方檢驗，x2=1.245，P=0.458，且在毛囊擴張評分上經(jīng)統(tǒng)計學(xué)比較兩者無顯著性差異P>0.05；低劑量組與模型組在毛囊擴張程度上經(jīng)卡方檢驗，x2=12.313，P=0.007，而局部組織毛囊擴張評分相比也顯示出統(tǒng)計學(xué)差異P<0.05；中劑量組與模型組的比較時發(fā)現(xiàn)中劑量組能顯著改善兔耳毛囊擴張程度，經(jīng)卡方檢驗x2=10.232，P=0.032，且對毛囊擴張評分的兩兩比較時發(fā)現(xiàn)P<0.01，差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義；高劑量組與模型組毛囊擴張程度相比經(jīng)卡方檢驗x2=10.036，P=0.031，毛囊擴張評分比較P<0.05；陽性藥物毛囊擴張程度分級及評分的組間比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與模型組經(jīng)卡方檢驗x2=11.027，P=0.008，評分比較P<0.01。從表中可知，在對兔耳毛囊擴張程度的影響上，中劑量組與陽性藥物組作用相當(dāng)，均有較強的治療作用，低劑量組與高劑量組也存在治療作用，但療效不如中劑量組與陽性藥物組。見表3。

3 討論

痤瘡是多種因素共同導(dǎo)致的皮膚病，痤瘡丙酸桿菌的定殖及炎癥反應(yīng)、皮脂腺分泌異常增多、毛囊口過度角化等是其發(fā)生的最重要的機制[14]。其中，毛囊皮脂腺導(dǎo)管的角化過度是痤瘡發(fā)病的基礎(chǔ)，是構(gòu)成痤瘡病理過程的主要環(huán)節(jié)之一，由導(dǎo)管角質(zhì)形成細胞過度增生和導(dǎo)管內(nèi)皮角化的細胞脫落減少引起[15]。炎癥反應(yīng)是痤瘡發(fā)病機制中的重要組成部分，多種細胞因子作用其中，導(dǎo)致局部炎癥反應(yīng)和機體對其發(fā)生免疫反應(yīng)[16-17]。由此可知，抗角化和抗炎癥因子是痤瘡治療的重要手段[13]。

歐陽恒教授“以皮治皮”理論認為，在辨病與辨證準確的基礎(chǔ)上選用皮類的藥物治療相關(guān)皮膚疾病，常可收到事半功倍的效果[18-19]。例如，根據(jù)痤瘡表現(xiàn)出來的粉刺、丘疹、結(jié)節(jié)、囊腫等病變的不同皮損形態(tài)，選用其皮損外形酷似或近似的藥材如石榴皮以治療。且經(jīng)過本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)石榴皮治療痤瘡療效突出，因此，進一步探索石榴皮中某種成份是否能有效治療痤瘡具有較大的研究價值。

前期研究發(fā)現(xiàn)石榴皮中石榴皮多酚為最主要的活性物質(zhì)，目前應(yīng)用廣泛，多個研究報道了石榴皮多酚有降脂、抗菌、抗炎等作用，且通過前期研究也發(fā)現(xiàn)了石榴皮多酚能有效抑制痤瘡發(fā)病的重要致病菌——痤瘡丙酸桿菌[17]， 因此，本研究從石榴皮多酚外用劑型軟膏入手，通過對兔耳粉刺模型的干預(yù)，觀察了不同濃度石榴皮多酚軟膏對兔耳粉刺模型皮膚的抗炎、抗角化作用。通過研究得出低、中、高劑量的石榴皮多酚軟膏均對兔耳粉刺模型有抗角化及抗炎作用，其中中劑量療效最顯著。本研究結(jié)果為“以皮治皮”理論提供了一定的實驗依據(jù)，也為臨床開發(fā)和應(yīng)用石榴皮多酚軟膏新藥提供了實驗依據(jù)。

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