超聲輔助提取花生殼中白藜蘆醇及人工胃腸液對其活性影響

高強 葉云 梁鴻飛 鐘英英

摘 要：采用響應面法優化超聲輔助提取花生殼中白藜蘆醇，以及人工胃腸液對白藜蘆醇活性的影響.以乙醇為提取溶劑，選擇乙醇用量、乙醇體積分數、超聲功率分數、提取時間作為單因素條件，通過響應面法優化并驗證提取工藝.最佳提取工藝：乙醇用量50 g、乙醇體積分數50%、超聲功率分數45%、超聲處理時間10 min，最優條件下，白藜蘆醇的提取率為2.166‰.人工胃腸液實驗的結果是：白藜蘆醇在胃液不降解而在腸液中降解.響應面實驗可以優化超聲輔助提取花生殼中白藜蘆醇，提高提取率.

關鍵詞：花生殼；白藜蘆醇；超聲輔助；人工胃腸液

中圖分類號：TQ353.42；TQ914.1 DOI：10.16375/j.cnki.cn45-1395/t.2018.04.010

0 引言

白藜蘆醇（resveratrol）廣泛分布于植物界，存在于虎杖、葡萄、花生、松樹等植物中，其中以虎杖含量最為豐富，白藜蘆醇具有抗菌、抗氧化、預防心臟病、抗癌等功效[1].目前白藜蘆醇的研究主要集中在虎杖和葡萄等植物中，對花生中白藜蘆醇的研究則較少[2].每年大量的花生殼被當作廢物丟棄，如果能充分利用，既可以提高花生種植的附加值，又可避免環境污染，使這些原本被廢棄的東西成為生產白藜蘆醇以及相關保健品的豐富資源[3].Cilibrasi等[4]發現白藜蘆醇可以影響Wnt信號通路抑制腫瘤細胞的增殖；Bai等[5]證明了白藜蘆醇在體外誘導人T24膀胱癌細胞凋亡和細胞周期阻滯.白藜蘆醇對于正常的人體細胞無害，具有高度選擇性和藥理活性，可以看做除紫杉醇外又一種綠色抗癌藥物[6].利用花生殼提取白藜蘆醇，可以低成本獲取高價值的白藜蘆醇.

白藜蘆醇有多種提取方式，包括微波輔助、超聲輔助和CO2超臨界萃取等提取技術[7-8].本文運用超聲波輔助法提取白藜蘆醇，同時對其進行優化，以期達到最大提取率.而后，采用人工胃腸液模擬體內胃環境對花生殼提取物進行處理，研究其抗氧化活性的變化[9].

1 材料與試劑

1.1 材料

柳州當地獲取花生殼原料，洗凈后置于60 ℃烘箱中（12 h），粉碎后過60目篩（0.250 mm），密封，陰涼處保存.

1.2 試劑

白藜蘆醇標準品購于成都曼思特生物科技有限公司，胃蛋白酶（豬胃黏膜）和胰蛋白酶（牛胰）購于上海源葉生物科技有限公司，其余試劑為國產分析純.

2 實驗方法

2.1 標準曲線及白藜蘆醇含量的測定

配置濃度分別是0、2.24、4.48、6.72、8.90、11.20、13.44、15.68 [μ]g/mL的白藜蘆醇標準液.在吸收波長為306 nm下測量兩次稀釋后的每個標準液的吸光度，平行測3次.以吸光度（A）對濃度（c）進行線性回歸，計算得回歸方程.

根據線性回歸方程得到濃度的大小，可計算白藜蘆醇的含量：

α=10-6×[c×10×25m×0.6]×1 000‰

α ——白藜蘆醇提取率/‰；c ——白藜蘆醇的質量濃度（μg/mL）；m——花生殼粉末的質量（g）；25 表示定容到25 mL；0.6 表示量取0.6 mL出來稀釋；10 表示量取的樣液稀釋到10 mL.

2.2 單因素實驗

2.2.1 乙醇用量

設置超聲功率分數40%，即240 W，提取時間15 min，超聲波細胞粉碎機選用6 mm的探針，超聲工作時間4 s，間隙時間5 s，報警溫度50 ℃，分別以20、30、40、50、60 g的乙醇用量，配置成60%的乙醇溶液來提取白藜蘆醇[10].在306 nm下檢測吸光度值.

2.2.2 乙醇體積分數

設置超聲功率分數40%，即240 W，提取時間15 min，超聲波細胞粉碎機選用6 mm的探針，超聲工作時間4 s，間隙時間5 s，報警溫度50 ℃，選定最佳乙醇用量，分別以40%、50%、60%、70%、80%的乙醇體積分數來提取白藜蘆醇[11].在306 nm下檢測吸光度值.

2.2.3 超聲功率

選定最佳的乙醇用量和乙醇體積分數，超聲波細胞粉碎機選用6 mm的探針，不同的超聲功率（30%、35%、40%、45%、50%，即180、210、240、270、300 W），超聲工作時間為4 s，間隙時間為5 s，提取時間15 min，報警溫度50 ℃，分別提取白藜蘆醇[12-13].在306 nm下檢測吸光度值.

2.2.4 超聲提取時間

選定最佳的乙醇用量、乙醇體積分數和超聲功率分數，超聲波細胞粉碎機選用6 mm的探針，超聲工作時間4 s，間隙時間5 s，報警溫度50 ℃，分別設置5、10、15、20、25 min的提取時間來提取白藜蘆醇[13].在306 nm下檢測吸光度值.

2.3 響應面試驗設計

響應面實驗通過Design-Expert 8.0.6 Trial 軟件 ，在單因素實驗結果的基礎上選定水平，對乙醇用量（A）、乙醇體積分數（B）、超聲功率分數（C）、超聲提取時間（D）4因素進行優化實驗[14-15].根據Box.Behnken 的中心組合設計原理設計探究實驗以及驗證實驗[16].試驗因素及水平見表1.

2.4 人工胃腸液模擬實驗

根據體外模擬實驗研究胃腸對丁香抗氧化活性物質的活性影響情況，用相同的方法來研究人工胃腸對白藜蘆醇活性的影響情況[17].人工腸胃液按照《中國藥典》（ 2010 版） 記載的方法配置.

參照劉亞等[18]的方法略做改動，用人工胃腸液處理過篩的花生殼，反應結束后，溶液用乙酸乙酯萃取3次，取上層溶液即乙酸乙酯層濃縮至干，用少許無水乙醇溶解定容到25 mL作為待測液，測吸光度[9，17]，每組測3次.

3 實驗結果

3.1 白藜蘆醇標準曲線

標準曲線在白藜蘆醇濃度為0～15.68 [μ]g/mL處的線性關系很好，得到回歸方程為y=0.100 2x+0.009 2，R2=0.999 7，符合使用要求[19]如圖1所示.對3次實驗求均值，計算與實驗結果的最大上下誤差.

3.2 單因素實驗結果

3.2.1 乙醇用量

由圖2可知乙醇用量為50 g時白藜蘆醇含量最高，達到1.974‰.

3.2.2 乙醇體積分數

由圖3可知，當乙醇體積分數達到50%時，花生殼中的白藜蘆醇基本上被完全提取出來，此時的白藜蘆醇提取率達到了2.307‰.

3.2.3 超聲功率

由圖4可知當超聲功率分數達到45%，即功率為270 W時，花生殼中的白藜蘆醇基本上被完全提取出來，此時的白藜蘆醇提取率達到了1.987‰[20].

3.2.4 提取時間

由圖5可知，當提取時間達到10 min時，花生殼中的白藜蘆醇基本上被完全提取出來，此時的白藜蘆醇提取率達到了2.066‰.

3.3 響應面實驗

3.3.1 優化實驗結果

依據表 1 中的因素與水平值，每個試驗組均進行3組平行試驗以減少誤差，其試驗結果見表 2.

對表2中響應面試驗結果進行多元回歸擬合分析[21].白藜蘆醇提取率對自變量乙醇用量（A）、體積分數（B）、功率分數（C）和提取時間（D）的二次多項回歸方程模型為：

白藜蘆醇提取率=2.25-0.015A+0.049B+0.023C+0.017D-0.020AB+0.017AC-5.000E-0.03AD-0.013BC+0.013BD-0.018CD-0.19A2-0.21B2-0.22C2-0.16D2

3.3.2 方差分析

由表3可知，該回歸模型極顯著（P<0.000 1），失擬誤差 P=0.089 7>0.05，不顯著，該回歸模型與試驗數據的擬合度較高.

根據響應面法試驗結果及其回歸方程模型分析可知，超聲輔助提取花生殼中白藜蘆醇的優化工藝條件為：乙醇用量49.61 g、乙醇體積分數51.61%、超聲功率分數44.77%、提取時間10.40 min，預測白藜蘆醇的提取率能達到2.184‰.按此最佳提取條件進行3次平行實驗.考慮到實驗操作的實際性，將上述最佳提取條件優化修正為乙醇用量50 g、乙醇體積分數50%、超聲功率分數45%、提取時間10 min.在修正條件進行實驗得到實際平均提取率2.166‰，與預測值相差較小.

白藜蘆醇提取率影響的大小關系為B（乙醇體積分數）>D（提取時間）>C（功率分數）>A（乙醇用量），其中乙醇體積分數對白藜蘆醇提取率的影響最大，最為顯著.

3.3.3 響應曲面分析

利用Design-Expert 8.0.6 Trial軟件中數據進行二次多元回歸擬合，得到如圖6所示的二次回歸方程的響應面圖.

響應面圖能夠直觀地觀察到各因素交互作用對提取率的影響，響應面坡度越陡，則表明交互作用越顯著，反之則表示交互作用不顯著.由圖6可以看出影響提取率各因子間的交互作用，最佳提取條件以及提取率，乙醇用量（A）以及體積分數（B）的交互作用最大，乙醇用量（A）以及提取時間（D）的交互作用最小，與方差分析結果一致.

3.4 人工胃腸液實驗

通過用體外實驗的方法模擬白藜蘆醇在胃腸液中的吸收情況，并檢測其在306 nm下的吸光值（A），觀察其白藜蘆醇含量變化如圖7所示.

經過人工胃液處理的白藜蘆醇樣液基本沒有降解，經過人工腸液處理后的白藜蘆醇樣液，出現降解.

經過人工胃液處理后白藜蘆醇含量提高的原因可能是在pH值較低的胃液環境中，白藜蘆醇粗提物中含有的一些多酚或者黃酮類化合物通過水解等一些化合反應生成了一些白藜蘆醇苷元，從而提高了白藜蘆醇的含量.此實驗結果有助于提升體內實驗的成功率.

4 結論

花生果殼在日常生活中屬于丟棄物，本次實驗采用花生殼作為研究材料，通過新型的超聲輔助法進行提取，能達到廢物利用的效果.

通過單因素實驗以及響應面優化實驗可以得出，乙醇用量49.73 g、乙醇體積分數51.62%、超聲功率分數44.70%、提取時間10.43 min，優化修正后的工藝條件下白藜蘆醇的提取率能達到2.184‰.其中乙醇體積分數對白藜蘆醇提取率的影響最大，最為顯著.對于腸胃液對白藜蘆醇活性的研究表明：胃液能抑制白藜蘆醇能降解而腸液促進降解.

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Study on ultrasonic assisted extraction of resveratrol from peanut shell and the effect of artificial gastrointestinal fluid on its activity

GAO Qiang， YE Yun， LIANG Hongfei， ZHONG Yingying*

（School of Biological and Chemical Engineering， Guangxi University of Science and Technology， Liuzhou 545006， China）

Abstract： Response surface method was used to optimize ultrasonic assisted extraction of resveratrol from peanut shell and the effect of artificial gastrointestinal fluid on resveratrol activity. Choosing ethanol as solvent， ethanol dosage， ethanol volume fraction， ultrasonic power fraction and extraction time as single factor conditions， the extraction process was optimized and validated by response surface method. The optimal extraction process is as follows： ethanol dosage being 50 g， ethanol concentration 50%， ultrasonic power score 45%， ultrasonic time 10 min， under optimum conditions， the extraction rate of resveratrol is 2.166 ‰. The result of the artificial gastrointestinal fluid experiment is that gastric juice can inhibit resveratrol degradation and intestinal fluid promotes degradation. Therefore response surface experiment can optimize ultrasonic assisted extraction of resveratrol from peanut shell and improve the extraction rate.

Key words： peanut shell； resveratrol； ultrasonic assisted； artificial gastrointestinal fluid

（學科編輯：黎 婭）