鮮食糯玉米己醛和己醇的生成與LOX活性及其基因表達(dá)的相關(guān)性

牛麗影 沈凌雁 劉春菊 李大婧 劉春泉 肖麗霞

摘要：為探討生鮮糯玉米汁主要揮發(fā)性成分己醛與己醇的生成與脂氧合酶（LOX）的關(guān)系，對(duì)4個(gè)籽粒發(fā)育期的鮮食糯玉米京甜紫花糯2號(hào)和蘇玉糯11號(hào)生鮮玉米汁中己醛與己醇含量、脂氧合酶活性以及ZmLOX1、Zm-LOX2、ZmLOX3、ZmLOX10基因的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行了測定和比較。結(jié)果顯示己醛與己醇含量顯著正相關(guān)（P<0.05），4種LOX基因的表達(dá)量之間顯著正相關(guān)（P<0.05），但LOX活性與其他指標(biāo)之間未表現(xiàn)出顯著的相關(guān)關(guān)系。主成分分析（ PCA）結(jié)果顯示所有指標(biāo)聚為3類：4種LOX基因表達(dá)量、己醛與己醇含量、LOX活性，三者之間未表現(xiàn)出顯著的相關(guān)性關(guān)系。

關(guān)鍵詞：鮮食糯玉米;己醛;脂氧合酶（LOX;基因表達(dá)量

中圖分類號(hào)：S513.01

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

文章編號(hào)： 1000-4440（2018）05-1138-06

糯玉米為起源中國的玉米類型，作為鮮食玉米廣受消費(fèi)者喜愛。鮮食糯玉米蒸煮后散發(fā)的玉米香與類似青葉、青草的清香是其重要特征之一。在鮮食糯玉米揮發(fā)性成分與香氣變化研究中發(fā)現(xiàn)，來自脂氧合酶（LOX）途徑的己醛和己醇為生鮮玉米汁揮發(fā)性成分的主要成分，并可能與糯玉米的青香有關(guān)。LOX途徑為LOX啟動(dòng)的具異戊二烯結(jié)構(gòu)的多元不飽和脂肪酸（Polyunsaturated fatty acid，PUFA）的氧化過程，植物中多以亞油酸和亞麻酸為底物，在LOX作用下生成9-氫過氧化物（9-HPOT）和13-氫過氧化物（13-HPOT），然后由氫過氧化物裂解酶（HPL）作用生成的C6醛和C9醛，并在乙醇脫氫酶（ADH）的作用下生成相應(yīng)的醇。其中C6的醛、醇、酮以及衍生的酯類被稱為青葉揮發(fā)性成分（Green leaf volatile， GLV）。GLV在植物生理研究中被作為抗逆反應(yīng)的標(biāo)志性成分，在番茄、黃瓜或柑橘中為新鮮香氣的表征成分，在豆類、速凍玉米、水稻等谷物中則與油脂氧化味等不良風(fēng)味相關(guān)。

從基因水平研究LOX途徑及風(fēng)味調(diào)控是近年來的趨勢(shì)。LOX是一個(gè)大基因家族，每種植物中都會(huì)有多個(gè)LOX同工酶，在番茄、蘋果等植物中只有某特定的LOX同工酶調(diào)控GLV的生成。目前已知玉米中有13種LOX，ZmLOX1基因存在于成熟籽粒中，具有9-LOX和13-LOX的非傳統(tǒng)型雙位點(diǎn)特異性;ZmLOX2基因在玉米生長發(fā)育過程中表達(dá).ZmLOX3存在于玉米植株的根部以及發(fā)育的胚中;ZmLOX10位于葉綠體中，主要調(diào)節(jié)GLV的生成。在對(duì)鮮食糯玉米LOX酶特性研究中發(fā)現(xiàn)，鮮食糯玉米中至少存在2種LOX同工酶，并且生鮮糯玉米汁的GLV則主要為己醛與己醇。為了在基因表達(dá)水平上探討鮮食糯玉米中GLV生成和香氣變化機(jī)制，本研究對(duì)2個(gè)品種4個(gè)發(fā)育期的鮮食糯玉米中己醛和己醇含量、LOX酶活性以及Zm-LOX1、ZmLOX2、ZmLOX3、Zm LOX10的相對(duì)基因表達(dá)量之間的相關(guān)性進(jìn)行分析，為鮮食糯玉米香氣的調(diào)控提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

糯玉米京甜紫花糯2號(hào)（JT）、蘇玉糯11號(hào)（SY）均采自江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院六合動(dòng)物科學(xué)基地試驗(yàn)田。2種糯玉米于授粉后14d、19d、25d、31d進(jìn)行采收，分別對(duì)應(yīng)于籽粒建成期、乳熟前期、乳熟后期和蠟熟期，記為JT1—4和SY1～4。采收當(dāng)日手工去除苞葉，分離完整玉米籽粒，液氮速凍后真空包裝，置于-80℃冰箱待用。

1.2 主要儀器和試劑

Agilent 7890A/5975C氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國Agilent公司產(chǎn)品;CAR/PDMS/DVB固相微萃取萃取頭，美國supelco公司產(chǎn)品;HP-INNOWAX毛細(xì)管色譜柱，美國Agilent公司產(chǎn)品;熒光定量PCR儀，美國Roche公司產(chǎn)品。Trizol試劑盒，美國Gibco公司產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 己醛、己醇含量的測定冷凍玉米粒10g加入40ml 4℃預(yù)冷的蒸餾水，迅速研磨，用5ml水轉(zhuǎn)移至均質(zhì)儀進(jìn)行均質(zhì)后定容到50ml，取5ml于15ml頂空瓶中并加入攪拌子及1.6g NaCl，密封后40℃水浴平衡15min，插入萃取頭（CAR/PDMS/DVB），使之與液面保持1.5cm的距離，加入攪拌子置于磁力攪拌器上，攪拌速度200 r/min，在40℃下萃取15min。色譜條件：色譜柱為HP-INNOWAX（30mx0.32mmx0.25μm）分析柱;升溫程序?yàn)椋浩鸪鯗囟?0℃保持2 min，然后5μ/min升溫至220cC，進(jìn)樣口溫度250℃，解析2min，采用不分流進(jìn)樣;載氣：He。質(zhì)譜條件：離子源溫度230℃，傳輸線溫度為150℃，電離化方式為EI、電子能量70eV，質(zhì)量掃描范圍m/z 30～ 450，掃描速率為5.27scan/s，溶劑延遲l min。定量方法采用外標(biāo)法，首先用色譜純甲醇配置1mg/ml的貯備液，再稀釋為0.2～200.0 mg/L的測定液，建立待測組分標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積與對(duì)應(yīng)質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2 LOX活性的測定同牛麗影等的方法 。

1.3.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR測定LOX基因表達(dá)量使用Trizol試劑盒提取樣品總RNA，用隨機(jī)引物將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDN。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為25℃10 min，42℃30 min.85℃5 min。根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，采用SYBR GREEN染料法，以GA PDH為內(nèi)參基因，測定LOX基因表達(dá)量，以乳熟期甜玉米晶甜3號(hào)為對(duì)照。引物序列見表l。PCR反應(yīng)條件為：94℃30s;94℃10s，60℃12s，72℃30s，循環(huán)45次，72℃單點(diǎn)檢測信號(hào)。采用2-？？法對(duì)結(jié)果進(jìn)行相對(duì)定量分析。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用JMP（JMP 10.0，SAS Institute Inc.）進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA）和主成分分析（PCA）。各指標(biāo)重復(fù)測定3次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用單因素方差分析（ANOVA） Tukey HSD進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同采收期兩種鮮食糯玉米中己醛和己醇含量比較

4個(gè)采收期兩種鮮食糯玉米京甜紫花糯2號(hào)（JT）和蘇玉糯11號(hào)（SY）中己醛含量為6.00～59.90μg/kg，己醇含量為0.11～8.29μg/kg。兩種糯玉米的己醛均在籽粒建成期含量最高，在乳熟期含量最低，到蠟熟期略有回升，但蠟熟期蘇玉糯11號(hào)的己醛含量與乳熟前期和乳熟后期京甜紫花糯2號(hào)差異未達(dá)顯著水平（圖1）。JT的己醇含量隨籽粒發(fā)育期的延長而呈降低趨勢(shì)，而SY的己醇含量變化不顯著。

2.2 兩種鮮食糯玉米脂氧合酶（LOX）活性比較

LOX活性測定結(jié)果（圖2）顯示，兩種糯玉米京甜紫花糯2號(hào)（JT）和蘇玉糯11號(hào)（SY） LOX活性均隨籽粒發(fā)育期延長呈現(xiàn)直線上升趨勢(shì)（R2=0.980 6、R2= 0.9978），在4個(gè)發(fā)育期兩種玉米的LOX活性并未表現(xiàn)出顯著差異（P>0.05）。

2.3 兩種鮮食糯玉米ZmLOX1、Zm LOX2、Zm-LOX3、ZmLOX10基因表達(dá)量差異

京甜紫花糯2號(hào)的4種LOX基因表達(dá)量在發(fā)育過程中變化趨勢(shì)一致，均為籽粒建成期≤乳熟后期≤乳熟前期<蠟熟期（圖3）。蘇玉糯11號(hào)的變化趨勢(shì)與京甜紫花糯2號(hào)不同，京甜紫花糯2號(hào)的4種LOX基因表達(dá)量均為蠟熟期最高，而蘇玉糯11號(hào)中ZmLOX3在乳熟后期表達(dá)量最高。另外，蘇玉糯11號(hào)ZmLOX1、ZmLOX2、ZmLOX10的表達(dá)量在4個(gè)時(shí)期均等于甚至低于京甜紫花糯2號(hào)籽粒建成期的最低值。2種玉米差異較大的為乳熟前期和蠟熟期，乳熟前期京甜紫花糯2號(hào)的ZmLOX2和Zm-LOX3基因表達(dá)量分別為蘇玉糯11號(hào)的117.25和4.92倍，蠟熟期京甜紫花糯2號(hào)的ZmLOX3基因表達(dá)量為蘇玉糯11號(hào)的5.54倍。另外，與GLV相關(guān)的ZmLOX10基因表達(dá)量京甜紫花糯2號(hào)大于蘇玉糯11號(hào)，對(duì)應(yīng)4個(gè)發(fā)育期京甜紫花糯2號(hào)的基因表達(dá)量分別為蘇玉糯11號(hào)的2.56、92.96、10.52和45.15倍。

2.4玉米己醇和己醛含量與LOX活性、LOX基因表達(dá)量的相關(guān)性分析

己醛和己醇是生鮮玉米汁中最主要的揮發(fā)性成分。通過調(diào)節(jié)pH以及加熱等方法抑制LOX的活性可以減少二者的生成，說明LOX途徑是二者生成的主要途徑。相關(guān)性分析結(jié)果（表2）顯示，己醛含量與己醇含量之間以及4種LOX基因表達(dá)量之間呈顯著正相關(guān)關(guān)系。己醇含量與己醛含量呈顯著正相關(guān)，說明生成的己醛越多，才能生成更多的己醇，但是二者的量與LOX活性、LOX基因表達(dá)量的相關(guān)性不顯著。

主成分分析（PCA）結(jié)果（圖4）表明，主成分l與主成分2可解釋總方差的87. 0%。從圖4中可以看出己醛與己醇含量、4種ZmLOX基因分別在第1象限和第2象限聚集。而樣品與指標(biāo)在空間上的接近則表明此樣品在此指標(biāo)上具有突出的特征，例如籽粒建成期的京甜紫花糯2號(hào)己醛與己醇含量最高，蠟熟期的京甜紫花糯2號(hào)ZmLOX基因表達(dá)量最高。

3 討論

不同植物的LOX代謝機(jī)制存在差別。本研究中京甜紫花糯2號(hào)和蘇玉糯11號(hào)2種糯玉米之間也存在顯著差異，例如在乳熟后期京甜紫花糯2號(hào)ZmLOX1、ZmLOX2、ZmLOX10基因表達(dá)量均高于蘇玉糯11號(hào)，在籽粒建成期和蠟熟期京甜紫花糯2號(hào)的己醛和己醇含量也高于蘇玉糯11號(hào)。京甜紫花糯2號(hào)和蘇玉糯11號(hào)糯玉米在發(fā)育過程中GLV的生成量和LOX活性存在顯著變化，但是與LOX基因表達(dá)量隨生長期的變化并不一致，未表現(xiàn)為顯著的相關(guān)性關(guān)系。獼猴桃中隨果實(shí)發(fā)育階段的延長，6種LOX基因表達(dá)量不同.AdLOX1和AdLOX5在成熟期間上調(diào)，而AdLOX2、AdLOX3、AdLOX4和AdLOX6則下調(diào)。番茄中TomLOXC基因只有在成熟時(shí)才被檢測到，被認(rèn)為是C6醛醇生成的功能基因。ZmLOX10在玉米植株受到傷害時(shí)表達(dá)量迅速增加，促進(jìn)GLV的產(chǎn)生。但在本研究中，在糯玉米籽粒建成期己醛與己醇含量最高，但籽粒發(fā)育后期ZmLOX10表達(dá)量最高，二者的變化并不一致。陳巧等研究發(fā)現(xiàn)黃瓜GLV含量與LOX基因表達(dá)間也未呈現(xiàn)顯著相關(guān)性，而且黃瓜中Cs LOX2基因表達(dá)高峰的出現(xiàn)先于LOX活性高峰。但是，Zhang等發(fā)現(xiàn)桃成熟過程中GLV含量與PpLOX一2、PpLOX一3、PpHPL-1和PpADHl-3等基因表達(dá)水平存在一致的變化趨勢(shì)。Boukobza等發(fā)現(xiàn)添加外源亞油酸/亞麻酸可以增加番茄GLV的生成，但是添加LOX或者乙醇脫氫酶（ADH）都不能影響GLV的生成。在氫過氧化物裂解酶（HPL）過度表達(dá)的番茄中，揮發(fā)性短鏈醛醇的量幾乎沒有改變。這些結(jié)果說明在番茄中GLV含量并不取決于LOX途徑中酶的基因表達(dá)量以及酶的活性。鮮食玉米中LOX活性與C6醛醇含量之間的相關(guān)性不顯著，而與亞油酸含量顯著相關(guān)。谷物（如水稻、玉米）種子中LOX基因表達(dá)量與病原菌入侵引發(fā)的抗逆機(jī)制以及發(fā)芽時(shí)的生理變化有關(guān)。LOX雖然是催化脂肪氧化的酶，但是在谷物中有水的情況下會(huì)加速反應(yīng)。鮮食糯玉米作為發(fā)育中的谷物種子，水分含量與果蔬接近，在蒸煮.制汁等條件下LOX作用的微環(huán)境和生化機(jī)制，及其對(duì)產(chǎn)品新鮮風(fēng)味的影響仍待進(jìn)一步研究。