基質對光譜法快速檢測蔬菜中殘留乙酰甲胺磷的影響

李文

摘要：為避免蔬菜殘留農藥理化檢測中耗時長、污染環(huán)境等不足，研究了蔬菜基質對光譜檢測乙酰甲胺磷的影響，建立了一種直接檢測蔬菜中殘留農藥的方法。選用白菜、芹菜提取液和去離子水分別配制3組農藥樣品，與乙酸氯化鈀溶液進行比色反應，對比分析300～900nm波段的吸收光譜和建立的偏最小二乘回歸（PLSR）模型。結果表明，兩種基質均可改變農藥樣品的特征波長，降低樣品吸光值的區(qū)分度，使PLSR模型預測精度明顯降低。改用差示分光光度法后，加入白菜、芹菜兩種基質后的PLSR模型驗證集的決定系數從0.90、0.92均提高到0.95，均方根誤差分別從10.64和9.89下降到7.64和6.98。說明采用差示分光光度法與PLSR模型相結合，可建立簡單易行的蔬菜殘留農藥快速定量檢測方法。

關鍵詞：基質;差示分光光度法; 比色光譜;農藥殘留

中圖分類號：X836

文獻標識碼： A

文章編號： 1000-4440（2018） 05-1169-05

近年來，農藥殘留超標問題日益突出，嚴重影響著人們的身體健康。為了有效保證蔬菜的食用安全，研究人員試驗了多種檢測技術和手段。但是由于蔬菜品種繁多，所含成分比較復雜，在樣品前處理過程中，需要添加多種溶劑以去除蔬菜中影響被測農藥的成分，凈化步驟非常繁瑣。黃雙根等采用無水硫酸鎂、Ⅳ一丙基乙二胺、石墨化炭黑和C18去除蛋白質、脂肪、碳水化合物等物質的影響，模擬農藥殘留狀態(tài)，利用拉曼光譜檢測白菜中的馬拉硫磷。熊俊飛等用類似方法去除芹菜中的影響成分，檢測苯醚甲環(huán)唑。這些方法不僅容易對環(huán)境造成二次污染，而且不易保證提取純度。相關研究結果證明，蔬菜的基質效應對常用的氣相色譜一質譜法檢測農藥殘留的影響不容忽視。此外，固相萃取、超臨界流體萃取、加速溶劑萃取等多種方法被應用在樣品前處理中，但是仍然存在操作復雜、耗時長、污染環(huán)境等缺點。

為了避免上述樣品前處理和檢測過程中的種種弊端，光譜技術被用于對含有蔬菜基質的農藥直接進行快速定量檢測的研究。鑒于目前研究蔬菜基質在紫外一可見光波段對農藥檢測影響的相關報告較少，本研究選用白菜和芹菜作為基質，結合前期的研究成果，在氯化鈀比色法基礎上，以乙酰甲胺磷為例，進一步研究兩種蔬菜基質對含硫基類有機磷農藥檢測的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

40%乳油乙酰甲胺磷，北京嘉禾種業(yè)有限公司產品;氯化鈀結晶粉末、乙醇（分析純）、冰乙酸（分析純）、去離子水，北京藍弋化工公司產品;無公害新鮮白菜、芹菜購自北京超市綠色蔬菜專賣區(qū)。

1.2 蔬菜基質制備

將白菜、芹菜菜葉用去離子水洗凈，晾干，切碎，榨汁，勻漿。以體積比1∶1加入無水乙醇，攪拌，振蕩，提取上清液，過0.22μm有機濾膜，濾液待用。

1.3 比色劑配制

稱取氯化鈀晶體1.0g，加入冰乙酸15ml，攪拌5 min，加去離子水稀釋到200ml，配制成0.5%的氯化鈀乙酸溶液，水浴45℃下密封放置30 min。

1.4 樣品制備

分別用去離子水、白菜和芹菜提取液配制3組乙酰甲胺磷溶液，每組包括46個不同農藥質量濃度的樣品，質量濃度范圍是0.5～90.0mg/L，每個樣品溶液體積為5ml。

1.5 測量方法

向每個樣品中滴入比色劑2ml，混勻，靜置2min后，以比色劑為參比液，使用UV-2450分光光度計在300～900 nm采集每個樣品的吸收光譜。此外，不改變參比液，分別采集白菜和芹菜基質的吸收光譜。

2 結果與分析

2.1 白菜和芹菜基質對乙酰甲胺磷樣品光譜特征的影響

由乙酰甲胺磷樣品的吸收光譜圖（圖1）可以看出，相對吸光值與乙酰甲胺磷質量濃度呈正相關關系，且在300～360 nm的紫外波段嚴重失真。但是，與不含蔬菜基質的對照相比，含有白菜和芹菜基質的乙酰甲胺磷樣品光譜在可見光波段發(fā)生明顯改變：①白菜和芹菜基質使被測農藥在340～440nm波段吸光值的區(qū)分度明顯減小，在430 nm處的特征峰消失;②兩種基質使各樣品在360～900nm波段的吸光值增大，且白菜基質的效果更明顯。因此，兩種蔬菜基質對乙酰甲胺磷比色光譜產生的影響不可忽視。

2.2 白菜和芹菜基質的光譜特征

白菜和芹菜基質的吸光譜圖（圖2）顯示，兩種基質均在300～330nm的紫外波段受到較大干擾，在340～380nm波段同時出現一個相對吸光值約為l的特征峰，在380～440nm波段吸光值最低且保持不變。在340～900nm波段白菜基質的吸光度大于芹菜基質的吸光度，二者的吸光值分別在500nm和600 nm處由負變正，且分別在690nm和680nm處出現一個較小的特征峰。

對比圖1和圖2.分析兩種基質對乙酰甲胺磷樣品比色光譜產生影響的原因。由于提取的白菜和芹菜基質分別呈現淺黃色和淡綠色，二者的互補色均為紫色，而紫色的吸收光譜在380～440nm，因此兩種基質的相對吸光度在該波段近似相等（約為-2）。此外，蔬菜提取液顏色對比色產物（黃色絡合物硫化鈀）顏色的影響，使得相應吸光度的變化量更微弱，所以含有白菜和芹菜基質的乙酰甲胺磷樣品吸光值在該波段的區(qū)分度明顯降低（圖1）。被測樣品的光譜形狀在380～440nm波段改變最大，表明兩種蔬菜基質的顏色是影響該波段比色光譜的主要原因。而在340～380nm、440～900nm波段白菜基質吸光值較高的原因可能是由于兩種基質所含成分的不同引起的。

2.3 基質對吸光值與樣品質量濃度之間相關性的影響

利用SG（Savitzky-Golay）卷積平滑高頻噪聲提高信噪比，計算3組光譜數據各波長處吸光值和樣品質量濃度之間的相關系數。由圖3可以看出，未加基質時，在可見光波段相關系數均大于0.在480nm處相關系數達到最大值（0.95）;加入白菜基質后，相關系數在700—900 nm波段降為負值，在498nm處相關系數最大（0.80）：加入芹菜基質后，在681nm處相關系數最大（0.86），且在500～900nm波段相關系數變化較小。表明兩種基質不僅改變了吸收光譜的特征波長，而且對部分波段吸光值與樣品質量濃度的相關系數的影響也非常顯著。

2.4 乙酰甲胺磷檢測的PLSR模型

由于3組光譜數據都存在多重共線性，若用全波段數據建立預測模型，不僅計算量大而且模型的穩(wěn)定性較差。偏最小二乘回歸（PLSR）不僅可以有效去除共線性，還可以提取主要的有效成分作為建模輸入信息。因此，根據最大相關系數原理，分別以3組數據各自的特征波長為中心，依次選擇不同的特征波段建立PLSR模型。5一折交叉驗證中，取驗證集的決定系數（R2）和均方根誤差RMSEP的10次平均值作為評價指標。

對比效果（表1）顯示，3組數據的特征波段都在可見光范圍，未加基質樣品的PLSR模型檢測效果比較理想。由于基質的顏色及所含成分引起被測農藥譜線的區(qū)分度降低，各波長處吸光值與樣品質量濃度的相關系數總體降低，使其PLSR模型的檢測精度降低。加入芹菜基質后在540～740nm波段吸光值與樣品質量濃度的相關系數相對較高，其PLSR模型的檢測精度比加入白菜基質的好，但與未加入基質的樣品相比，預測精度仍然較低。因此，有必要進一步提高蔬菜基質中被測農藥的預測精度。

2.5 差示光度法對乙酰甲胺磷檢測PLSR模型精度的影響

加入白菜和芹菜基質后PLSR模型精度低的主要原因是吸光值的區(qū)分度減小，而且被測樣品的質量濃度變化范圍（0.5～90.0mg/L）可能超出朗伯一比爾定律的線性范圍，導致較高質量濃度段和較低質量濃度段樣品的檢測誤差較大。為此，采用差示光度法，將參比溶液更換為一定質量濃度的被測溶液，對高、低質量濃度段的樣品分別采用高吸光度差示法和低吸光度差示法以提高光譜的采集精度。對高質量濃度樣品，用質量濃度比被測溶液稍低的標準溶液作為參比溶液，調節(jié)分光光度計透光率T=100%，再測定樣品濃度Cx，如果得到T= 50.0%，二者之差為50%，相當于把標尺擴大了10倍，測量讀數的相對誤差也就縮小了10倍。根據朗伯一比爾定律，差示法的公式表達為：△A=k（Ck-Cx）L，式中△A為相對吸光度，k為入射光的吸收系數，Cs和Cx分別為被測溶液和參比溶液的濃度，L為光程。上式表明，在符合朗伯一比爾定律測定濃度范圍內，示差法測得的相對吸光度（△A）與被測溶液和參比溶液的濃度差（Cs-Cx）成正比，可用于定量測定。此時溶液的△T= 50%，讀數在適宜的范圍內，提高了測定的準確度。同樣道理，測定低質量濃度樣品時，用濃度比樣品溶液稍高的標準溶液作為參比溶液，調節(jié)光度計的透光率為0。

經過比較大量試驗數據，最終確定白菜和芹菜基質的PLSR模型預測精度（表1）。在建模波段和主成分數量相同的情況下，兩種基質下模型驗證集決定系數分別從0.90、0.92提高到0.95，RMSEP分別從10.64、9.89下降到7.64和6.98，證明示差法可以有效減小基質對殘留農藥檢測的影響，實現直接定量檢測蔬菜殘留農藥的目標。

3 結論

本研究將比色法、差示光度法和PLSR建模相結合，通過分析白菜和芹菜提取液作為基質對乙酰甲胺磷檢測的影響，建立了一種直接檢測蔬菜基質中農藥的快速方法。該方法簡化了樣品前處理過程，避免了使用大量溶劑提取被測農藥的繁瑣步驟。得到以下結論：（1）白菜和芹菜基質對乙酰甲胺磷比色光譜的影響因素主要是基質的顏色和成分。基質顏色的影響主要表現在2個方面：一是基質顏色本身的吸收光譜改變了被測樣品的紫色波段（約380～440nm）譜線形狀，使該波段不能作為PLSR建模波段：二是基質顏色對比色反應產物的顏色形成干擾，使樣品吸光值的區(qū)分度減小，降低了PLSR模型的預測精度。基質成分的影響主要使樣品各波長點的吸光值增大，對PLSR模型精度的影響較小。（2）常規(guī)數據預處理無法消除基質的影響以提高PLSR模型精度。通過改用吸光度差示法采集吸收光譜，PLSR模型預測精度明顯提高，加入白菜和芹菜基質的驗證集的決定系數均達到0.95，均方根誤差分別下降到7.64和6.98，可以直接定量檢測蔬菜基質中的農藥含量。（3）由于本研究的比色原理是氯化鈀在酸性環(huán)境下和含硫基的化合物反應形成黃色絡合物硫化鈀，因此這一方法也適用于其他常見的含硫基類農藥如樂果、毒死蜱等。通過進一步研究更多蔬菜基質對含硫基類農藥檢測的影響，建立統(tǒng)一的蔬菜農殘快速檢測方法，可為研發(fā)實用的農藥殘留檢測儀器提供有益參考。