泌尿道解葡萄糖苷棒狀桿菌的分離、鑒定和藥敏分析

韋柳華 羅國蘭 李夢薇 林盛張 周格琛 鄒燕

中圖分類號 R978.1 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）04-0496-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.04.16

摘 要 目的：對臨床分離的解葡萄糖苷棒狀桿菌進行鑒定和藥敏分析，為臨床用藥提供參考。方法：將從我院泌尿系統(tǒng)結石致尿路感染患者中段尿標本中分離得到的2株菌株接種至哥倫比亞血平板和麥康凱平板上，觀察其生長情況并計數(shù)；采用基質(zhì)輔助激光解析飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）檢測菌株的蛋白質(zhì)譜圖；提取菌株DNA，采用聚合酶鏈反應擴增其16S核糖體RNA（rRNA）序列，對片段大小約為1 500 bp的目標條帶進行雙向測序，并與GenBank數(shù)據(jù)庫進行Blast比對，鑒定菌種；采用Etest法監(jiān)測2株菌株的耐藥情況。結果：2株菌株在哥倫比亞血平板上生長（菌落數(shù)>105 CFU/mL），在麥康凱平板上不生長；均為革蘭氏陽性棒狀桿菌，多呈柵欄樣或八字形排列。MALDI-TOF-MS鑒定其均為解葡萄糖苷棒狀桿菌，可信度為99.9%，在m/z 2 431、3 089、3 364、3 378、4 200、5 508、6 302、6 637、6 730、6 946、12 603處出現(xiàn)特征峰；Blast比對結果顯示，2株菌株與GenBank中已知解葡萄糖苷棒狀桿菌的序列同源性超過98%。藥敏試驗結果顯示，菌株1對頭孢曲松、環(huán)丙沙星耐藥，對青霉素G等其他14種抗菌藥物敏感；菌株2對頭孢曲松、紅霉素、環(huán)丙沙星、四環(huán)素、克林霉素耐藥，對頭孢噻肟中介，對其他10種抗菌藥物敏感。結論：2株菌株均為解葡萄糖苷棒狀桿菌，對常用抗菌藥物的耐藥性有所差異。該菌為罕見的泌尿道病原菌，且呈多重耐藥，臨床應根據(jù)菌株鑒定及藥敏試驗結果合理選用抗菌藥物。

關鍵詞 尿路感染；解葡萄糖苷棒狀桿菌；基質(zhì)輔助激光解析飛行時間質(zhì)譜；鑒定；藥敏試驗

ABSTRACT OBJECTIVE： To identify and analyze drug sensitivity of Corynebacterium glucuronolyticum iscolated from clinic， and to provide reference for clinical drug use. METHODS： Two strains isolated from the urine specimens of urolithiasis-induced urinary tract infection patients in our hospital were inoculated into Columbia blood plate and the MacConkey plate. The growth of strains was observed and counted. Protein mass spectrometry of strains was detected by MALDI-TOF-MS. DNA of strains was extracted， and PCR was used to amplify the 16S ribosome RNA （rRNA） sequence. Bi-directional sequencing of 1 500 bp target bands was conducted. Blast comparison between it and GenBank database was conducted to identify bacterial strain. Drug resistance of 2 strains was monitored by Etest assay. RESULTS： Two strains grew on the Columbia blood plate （with colony forming unit >105 CFU/mL） and did not grow on the MacConkey plate. Two strains were Gram-positive Corynebacterium and showed palisading or eight type arrangement. Two strains were C. glucuronolyticum by MALDI-TOF-MS identification， with reliability of 99.9%. The characteristic peaks of m/z 2 431， 3 089， 3 364， 3 378， 4 200， 5 508， 6 302， 6 637， 6 730， 6 946， 12 603 appeared. Blast comparison showed that the sequence homology of 2 strains compared with C. glucuronolyticum strain known in GenBank were higher than 98%. Results of drug sensitivity test showed that strain 1 was resistant to ceftriaxone and ciprofloxacin， and sensitive to 14 other antibiotics as penicillin G； strain 2 was resistant to ceftriaxone， erythromycin， ciprofloxacin， tetracycline and clindamycin， moderately sensitive to cefotaxime， and sensitive to 10 other antibiotics. CONCLUSIONS： Two strains are C. glucuronolyticum， and drug resistance of them to commonly used antibiotics is different. The strains are rare pathogen of urinary tract and show multidrug resistance. Antibiotics should be selected according to the results of strain identification and drug sensitivity test.

KEYWORDS Urinary tract infection； Corynebacterium glucuronolyticum； MALDI-TOF-MS； Identification； Drug sensitivity test

棒狀桿菌是革蘭氏陽性、需氧或兼性厭氧桿菌，常定植于人體皮膚和黏膜表面[1]。雖然棒狀桿菌可引起尿路感染，但是由解葡萄糖苷棒狀桿菌引發(fā)的感染極為罕見[2-4]。解葡萄糖苷棒狀桿菌生長緩慢，容易漏檢（尤其當檢出量較小時），且對多種抗菌藥物耐藥，給臨床診斷和治療增加了難度[5]。該菌可從有以下易感因素的患者的尿液中分離，包括曾接受過泌尿系統(tǒng)手術、長時間留置導尿管、住院期間長期使用廣譜抗菌藥物、腎移植術后行免疫抑制劑治療、發(fā)生全身炎癥反應等[6]。若患者出現(xiàn)排尿困難和血尿，尤其是在腎移植或泌尿系統(tǒng)手術后，建議進行解葡萄糖苷棒狀桿菌篩查，以排除其致泌尿道感染的可能，以免延誤診斷和治療時機[7]。本文以2例泌尿系統(tǒng)結石所致尿路感染患者中段尿中分離出的解葡萄糖苷棒狀桿菌作為研究對象，對其進行分離、鑒定和藥敏試驗，以期為臨床診斷和治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 菌株來源

2株菌株均是從2016年我院泌尿系統(tǒng)結石致尿路感染患者的中段尿標本中分離所得。

1.2 材料

哥倫比亞血平板、麥康凱平板[梅里埃（上海）生物制品有限公司，批號分別為1004849840、1004820630]；含5%羊血的M-H培養(yǎng)基（溫州康泰生物科技有限公司，批號：PD200365）；VITEK MS型基質(zhì)輔助激光解析飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）儀、靶板（VITEK MS-DS）和基質(zhì)液（VITEK MS-CHCA）以及質(zhì)控菌株大腸埃希菌（ATCC 8739）均由法國生物梅里埃公司提供；ABI 7500型聚合酶鏈反應（PCR）儀（美國Applied Biosystems公司）；TIANamp Bacteria DNA Kit細菌基因組DNA提取試劑盒（離心柱型，北京天根生化科技有限公司）；PCR反應相關試劑（包括引物、Taq mix等，美國Thermo Scientific公司）；16S核糖體RNA（16S rRNA）引物合成由北京六合華大基因公司完成；Alphamager HP型凝膠成像系統(tǒng)（美國ProteinSimple公司）；BX53型顯微鏡（日本奧林巴斯株式會社）；Etest條由溫州康泰生物科技有限公司提供。

1.3 細菌培養(yǎng)和計數(shù)

1.3.1 細菌培養(yǎng) 將尿液標本混勻，用定量接種環(huán)取上述標本各10 μL，分別接種于哥倫比亞血平板和麥康凱平板中，于35 ℃下孵育24～48 h，觀察細菌生長情況。

1.3.2 細菌計數(shù) 統(tǒng)計平板上的菌落數(shù)，將菌落數(shù)×102計為每毫升尿液中所含的細菌數(shù)（CFU/mL）；若菌落生長過多無法精確計數(shù)，則計為>105 CFU/mL。細菌培養(yǎng)和計數(shù)按照《全國臨床檢驗操作規(guī)程》（第4版）[8]進行。

1.4 MALDI-TOF-MS鑒定

用1 μL定量接種環(huán)將質(zhì)控菌株涂布至靶板上的校準點位，然后取待測菌株菌落1～2個，涂布至靶板點位上，每點位各加入基質(zhì)液1 μL，室溫干燥后放入MALDI-TOF-MS儀中，以獲取待測菌株的全細胞蛋白質(zhì)譜圖；然后將待測菌株的質(zhì)譜圖和數(shù)據(jù)庫已知菌種的質(zhì)譜圖進行比較，獲得鑒定結果。結果判定參照MALDI-TOF-MS結果判斷標準——結果可信度>60%，僅有1個鑒定選項，為好的鑒定；可信度>60%，但有2～4個鑒定選項，為低分辨率的鑒定，需要補充水解七葉苷試驗[9]予以區(qū)分；可信度<60%；有4個以上鑒定選項或無鑒定選項，為不能鑒定。

1.5 16S rRNA測序

按照TIANamp Bacteria DNA Kit細菌基因組DNA提取試劑盒操作說明書進行DNA提取，并對提取的DNA進行PCR擴增。PCR正向引物27F：5′ -AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′ ，反向引物1492R：5′ -TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′ 。擴增體系含2×Taq mix 15 μL、正向引物（10 μmol/L）2 μL、反向引物（10 μmol/L）2 μL、DNA模板1 μL、ddH2O 10 μL，加無菌純水至30 μL。反應條件為95 ℃預變性3 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)；最后72 ℃再延伸10 min。取PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，于凝膠成像系統(tǒng)上成像。將片段大小約為1 500 bp的目標條帶送至北京六合華大基因公司進行雙向測序。測序結果在美國國立生物技術信息中心（NCBI）GenBank數(shù)據(jù)庫（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）中進行Blast比對，將序列同源性>97%（按16S rRNA基因序列）的菌株歸為同一菌種[10]。

1.6 藥敏試驗

采用Etest法進行藥敏試驗。用無菌棉簽挑取待測菌株菌落3～5個置于無菌鹽水中，配制成相當于0.5麥氏濁度單位的菌懸液。用無菌棉簽蘸取上述菌液均勻涂布在含5%羊血的M-H培養(yǎng)基上（操作方法同紙片擴散法），靜置3～5 min后，將Etest條垂直插入培養(yǎng)基中，于35 ℃下孵育16～20 h，讀取橢圓形抑菌圈邊緣與Etest條交叉處的藥物濃度，即該藥對該菌株的最低抑菌濃度（MIC）。藥敏試驗數(shù)據(jù)采用WHONET 5.6軟件進行處理，其結果判定參照美國臨床和實驗室標準化協(xié)會（CLSI）2015年的標準[11]。

2 結果

2.1 培養(yǎng)結果

2株菌株在哥倫比亞血平板上生長，在麥康凱平板上不生長。孵育24 h時，菌落較小；孵育48 h時，菌落明顯增加，且呈奶白色，較為黏稠；細菌菌落數(shù)均超過105 CFU/mL。挑取菌落行革蘭氏染色鏡檢，顯微鏡下為革蘭氏陽性棒狀桿菌，排列不規(guī)則，多呈柵欄樣或八字形排列，詳見圖1。

2.2 MALDI-TOF-MS鑒定結果

經(jīng)MALDI-TOF-MS鑒定為解葡萄糖苷棒狀桿菌，可信度為99.9%，且僅有1個鑒定選項。該菌在m/z 2 431、3 089、3 364、3 378、4 200、5 508、6 302、6 637、6 730、6 946、12 603處出現(xiàn)特征峰，詳見圖2。

2.3 16S rRNA測序結果

將2株菌株的16S rRNA測序結果（圖3）與GenBank數(shù)據(jù)庫進行Blast比對。結果顯示，2株菌株與GenBank中已知解葡萄糖苷棒狀桿菌（基因登錄號：GG667131.1）的序列同源性超過98%，屬于同一菌種，詳見圖4。

2.4 藥敏試驗結果

菌株1對頭孢曲松、環(huán)丙沙星耐藥，對青霉素G等其他14種抗菌藥物敏感；菌株2對頭孢曲松、紅霉素、環(huán)丙沙星、四環(huán)素、克林霉素耐藥，對頭孢噻肟中介，對其他10種抗菌藥物敏感，詳見表1。

3 討論

解葡萄糖苷棒狀桿菌引起的感染較為少見，可引起非淋菌性尿道炎、結痂性膀胱炎、前列腺炎、肉芽腫性乳腺炎等[5，12-13]。該菌也可從血液和腹腔液中分離，但極為罕見[13]；此外，該菌除可從人泌尿生殖道中檢出外，還可從另外一種哺乳動物豬的泌尿生殖道中檢出[14]。

棒狀桿菌引起的感染往往具有爭議，因為大多數(shù)棒狀桿菌是皮膚定植菌。本研究從2例泌尿系統(tǒng)結石患者的尿液標本中分離得到了2株解葡萄糖苷棒狀桿菌。患者多次送檢尿液標本，病原菌大量生長，尿沉渣分析顯示其存在菌尿，且尿白細胞增高，故考慮該菌可能是一種潛在的泌尿道病原菌。文獻報道解葡萄糖苷棒狀桿菌可引起青年男性尿道炎，該菌可從有臨床癥狀的患者中分離，不能視為泌尿生殖道的定植菌[13]。因此，當棒狀桿菌在臨床標本中優(yōu)勢大量生長或者在生理無菌部位大量生長時應評估其致病性，并進行鑒定。同時，解葡萄糖苷棒狀桿菌生長緩慢，應延長培養(yǎng)時間，避免漏檢[5]。

棒狀桿菌和疾病之間的關系依賴于菌種的準確鑒定[15]。然而，棒狀桿菌鑒定到種卻較為困難，傳統(tǒng)的生化鑒定方法操作煩瑣、耗時，且無法提供可靠的結果[1]。分子測序技術是鑒定棒狀桿菌的“金標準”，但耗時長、成本高，且需要檢測人員接受專門培訓，故不能在臨床微生物實驗室常規(guī)使用[1]。因此，一些基層醫(yī)院微生物實驗室鑒定棒狀桿菌往往局限于種屬或描述性報告（如：革蘭氏陽性桿菌）。棒狀桿菌不能準確鑒定，其臨床意義可能被低估，治療將被延誤[7]。MALDI-TOF-MS是一種新型微生物鑒定技術，在鑒定細菌和酵母菌上具有準確、快速、方便、成本低、高通量的優(yōu)點[16]。多項研究顯示，MALDI-TOF-MS能準確將棒狀桿菌鑒定到種，且速度極快，每株菌株的鑒定在10 min內(nèi)即可完成[1，17]。MALDI-TOF-MS技術提高了微生物實驗室的工作效率，對幫助認識棒狀桿菌潛在的致病性、及時診斷和治療具有重要價值。

目前，關于解葡萄糖苷棒狀桿菌的藥敏試驗數(shù)據(jù)報道較少。國外文獻報道，該菌對β-內(nèi)酰胺類、萬古霉素、復方磺胺甲噁唑、利福平、利奈唑胺敏感，對克林霉素、紅霉素、四環(huán)素耐藥；對慶大霉素、環(huán)丙沙星的MIC范圍廣，藥敏試驗結果不定，可能是敏感、中介或耐藥[5，13，18]。本研究藥敏試驗結果顯示，菌株1對頭孢曲松、環(huán)丙沙星耐藥；菌株2則表現(xiàn)出多重耐藥性，對頭孢曲松、紅霉素、環(huán)丙沙星、四環(huán)素、克林霉素均耐藥，對頭孢噻肟中介，與國外文獻報道[13]的結果相近。值得關注的是，2株菌株對紅霉素、四環(huán)素、克林霉素、頭孢噻肟的耐藥性存在差異。筆者認為，菌株2對紅霉素耐藥的機制可能與藥物作用靶位的改變有關，該菌攜帶核糖體甲基化酶基因（如ermX），可使紅霉素作用的核糖體蛋白甲基化，藥物作用靶位核糖體50S亞基蛋白改變，藥物與靶位的親和力下降，導致耐藥。另外，由于大環(huán)內(nèi)酯類、林可酰胺類和鏈陽菌素B等3種抗菌藥物在細菌的核糖體上有相似的作用位點，因此在此機制作用下，可導致菌株對大環(huán)內(nèi)酯類、林可酰胺類和鏈陽菌素B交叉耐藥[19-20]。菌株2對四環(huán)素耐藥的機制可能為：（1）核糖體保護蛋白基因（如tetW）的表達增強，大量生成的核糖體保護蛋白與核糖體相互作用，保護細菌的蛋白質(zhì)合成不受藥物影響[19]；（2）細菌產(chǎn)生四環(huán)素類藥物泵出基因（如tetAB），其表達的膜蛋白具有排出四環(huán)素-陽離子復合物的作用，使菌體內(nèi)藥物濃度降低[20]。2株菌株對頭孢噻肟的敏感性不同，機制可能與青霉素結合蛋白（PBP）和第三代頭孢菌素的親和力下降、PBP增多或產(chǎn)生新的PBP使抗菌藥物失去活性等因素有關[21]。另外，2株菌株對環(huán)丙沙星耐藥很可能是由gryA基因突變引起的[22]。鑒于2株解葡萄糖苷棒狀桿菌藥敏試驗結果差別較大，實驗室有條件時應進行藥敏試驗，以指導抗菌藥物的合理選擇。本次分離的2株菌株均來自于泌尿外科病區(qū)的不同患者。其中，1例患者（分離出菌株1）經(jīng)驗性使用環(huán)丙沙星治療1周，癥狀無改善，尿培養(yǎng)仍檢出該菌，后依據(jù)藥敏試驗結果調(diào)整為復方磺胺甲噁唑治療1周，癥狀明顯改善，再次尿培養(yǎng)示無細菌生長，患者痊愈出院。另1例患者（分離出菌株2）在經(jīng)驗性使用環(huán)丙沙星治療無效的情況下，醫(yī)師依據(jù)以往經(jīng)驗和藥敏試驗結果更換為復方磺胺甲噁唑，雖然該藥MIC（0.125 μg/mL）并非最低，但治療效果較好，患者痊愈。

綜上所述，解葡萄糖苷棒狀桿菌是一種罕見的泌尿道病原菌，由該菌所致的感染應引起臨床的重視。該菌對多種抗菌藥物耐藥，可導致診斷及治療時機的延誤。因此，微生物實驗室應盡量進行菌株鑒定和藥敏試驗，為患者的臨床治療提供參考。MALDI-TOF-MS技術在棒狀桿菌的鑒定上具有快速、準確、操作簡便等優(yōu)勢，是一種新型微生物鑒定技術，有望在不久的將來取代傳統(tǒng)的微生物鑒定方法。但本研究納入的解葡萄糖苷棒狀桿菌數(shù)量極少，藥敏試驗數(shù)據(jù)尚不能全面反映該菌的耐藥特征，加之鑒于該菌的高耐藥性及其對臨床的影響，繼續(xù)對解葡萄糖苷棒狀桿菌進行耐藥性監(jiān)測非常必要。

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（收稿日期：2017-02-21 修回日期：2017-11-27）

（編輯：張元媛）