轉基因番木瓜檢測方法的建立

王恒波 余澤懷 肖乃衍 張華 陳平華

關鍵詞：轉基因番木瓜;篩選;定性聚合酶鏈式反應（PCR）;檢測

中圖分類號：S667.9

文獻標識碼：A

文章編號： 1000-4440（2018） 05-1198-03

番木瓜（Carica papaya）是一種有較高食用和藥用價值的草本果樹，番木瓜蛋白酶廣泛應用于醫藥、美容、日化品等行業。番木瓜環斑花葉病毒（PRSV）是危害番木瓜生產的一種世界性病毒，植株受到侵染后，無法進行有效治療，目前的化學殺菌劑不能有效控制其蔓延。培育抗病品種是防治環斑花葉病毒最緊迫的任務之一，但番木瓜栽培品種中缺乏有效抗病基因資源。直到1986年，Abel等報道了病毒基因轉入寄主植物，導致植物產生抗性的現象，受此啟發，育種家們開始使用轉基因技術解決番木瓜抗環斑花葉病毒問題，抗環斑病毒的轉基因番木瓜應運而生。

目前，有3個轉基因番木瓜轉化事件存在。第一，20世紀90年代初夏威夷大學的Fitch等，將一種環斑花葉病毒（PRSV）編碼的外殼蛋白（CP）基因轉入番木瓜，經過逐步雜交育種，得到了轉基因番木瓜Rainbow，1998年5月在夏威夷正式投入商業化生產。第二，利用PRSV優勢毒株Ys的復制酶（RP）基因，獲得高抗Ys、Vb、Sm等株系的轉基因番木瓜華農一號，于2006年獲得農業部的安全生產證書。第三，將PRSV YK毒株的CP基因轉入栽培品種臺農2號，于2001年開始進行田間試驗和生產安全評估試驗。

目前，針對番木瓜轉基因成分篩查，還沒有形成統一的檢測方法，在檢測相關標準中，關于胭脂堿合成酶基因啟動子（NOS-P）和CP基因檢測引物篩選和驗證的相關報道較少。本研究擬針對世界上現有轉基因番木瓜的CP基因和NOS-P，設計相應的檢測引物，建立適合番木瓜轉基因成分篩查的方法，為轉基因標識制度的順利執行提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

轉基因番木瓜（GMYK系列的16-0-1和Rainbow、華農一號）、轉基因水稻（科豐6號、TT51-1）、轉基因大豆（GTS40-3-2、MON89788、A2704、A5547-127）、轉基因玉米（MON810、MOIN863、NK603、T25、TC1507、Btll、Bt176、GA21）和非轉基因番木瓜（紅妃2號）等試驗材料.均由農業部甘蔗及制品質量監督檢驗測試中心保存。

1.2 試驗方法

1.2.1 試劑 PCR反應試劑SYBR Premix、ExTaq酶、dNTPs、Buffer均購自TaKaRa公司，100 bp Ladder DNA mark-er和植物基因組提取試劑盒（DP305）購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2.2 PCR檢測引物 查閱NCBI網站上GenBank數據庫中CP相關的核苷酸序列（編號為FJ467933.1、AF196839.1和YK X78557.1），利用Primer5.O軟件分別設計番木瓜環斑病毒CP基因和NOS-P的特異性檢測引物。內源基因Papa-in檢測引物采用文獻所述方法進行設計。試驗中所用引物均由南京金絲瑞生物工程有限公司合成。

1.2.3 PCR反應體系與程序定性和定量PCR反應體系以及擴增程序參照文獻的方法進行設計。退火溫度的優化：在梯度PCR儀上設置10個退火溫度，分別為50.2℃、50.7℃、51.6℃、52.7℃、54.0℃、55.4℃、56.8℃、58.1℃、59.2℃、60.O℃。

2 結果與分析

2.1 內源基因Papain的特異性PCR擴增

番木瓜果實中富含多糖、果膠、酚類等物質，極易對Taq酶的活性產生影響。通過對番木瓜內源基因Papain，的檢測，來判斷提取DNA的質量。所有番木瓜樣品均能獲得與預期大小（211bp）相符的擴增產物，表明番木瓜DNA適合PCR檢測。

2.2 利用定量PCR染料法對CP基因和NOS-P檢測引物進行驗證

基于CP基因的保守序列，設計5對檢測引物，在相同反應條件下，依據Ct值的大小、熔解曲線形狀及熔解曲線高度，篩選出轉基因番木瓜最佳的檢測引物。CP-4引物起峰最早，Ct值為24.87，CP-2引物、CP-1引物、CP-3引物、CP-5引物的Ct值分別為28.60、27.02、26.62、25.76。分析5對引物熔解曲線的形狀，只有引物CP-4是典型的單峰型曲線，最適合用作CP基因的檢測引物，其他引物都存在多峰現象，表明存在多個非特異性擴增片段。同時，基于NOS-P序列，設計了1對檢測引物，進行定量PCR擴增，NOS-P引物的熔解曲線也是典型的單峰型曲線，適合作為NOS-P的檢測引物。

2.3 不同退火溫度下Papain、CP基因和NOS-P的PCR檢測條件優化

同種引物在不同退火溫度下產生的條帶間存在強弱變化。隨著溫度的逐漸升高，Papain基因產生的特異性目的條帶沒有發生任何變化，說明該引物設計合理且擴增效率高。NOS-P檢測引物產生的特異性條帶，隨著溫度的逐漸升高，目的條帶逐漸減弱，當退火溫度達到58.1℃時，目的條帶消失，說明該引物退火溫度范圍窄，擴增效率低。CP基因檢測引物產生的特異性目的條帶，隨著溫度的升高逐漸增強，當退火溫度為56.8～60.O℃時，產生的目的條帶亮度最強。為了防止低含量的轉基因番木瓜在實際檢測過程中漏檢，本研究經過篩選得出，Papain，基因、CP基因和NOS-P的最佳退火溫度分別為54.O℃、58.0℃、54.0℃。

2.4 CP基因和NOS-P檢測引物特異性的PCR驗證

針對CP基因的特異性檢測，只有轉基因番木瓜16-0-1和Rainbow出現了預期的368 bp的目的片段，華農一號未檢測出目的條帶。針對NOS-P的特異性檢測，轉基因番木瓜16-0-1、Rainbow和華農一號均出現了預期的173 bp的目的片段，其他測試材料均未檢測到任何片段。本研究的檢測結果與韓建勛等的結果相符，表明本研究設計與篩選的引物在不同轉基因材料中具有較高的特異性。

2.5 檢測引物的靈敏度

將轉基因番木瓜16-0-1和非轉基因番木瓜紅妃2號的DNA溶液（初始濃度均為100 ng/μl）按不同比例混合，配制成轉基因番木瓜DNA相對含量為20.0%、5.0%、1.0%、0.5%、0.1%的樣品，在CP基因和NOS-P已經優化好的退火溫度58.0℃、54.0℃下進行PCR擴增。本研究篩選出的檢測引物具有很高的靈敏度，在相對含量為0.1%以上的樣品中均能檢測出特異性目的條帶。

3 討論

中國對轉基因生物及產品實行強制標識制度，因此，需要檢測機構對市場上的番木瓜進行轉基因成分例行監測，以維護中國消費者的選擇權和知情權。根據檢測的靶序列差異、外源基因與質粒載體上的組合以及植物基因組上的整合位點，檢測方法分為篩選檢測、基因特異性檢測、結構特異性檢測、轉化事件特異性檢測。一般情況下，篩選檢測以啟動子、終止子等通用元件為檢測對象，初步判斷是否含有外源基因。番木瓜轉基因成分篩查通常以CaMV35S啟動子、NOS-P、NOS終止子等元件為靶序列。基因特異性檢測以轉入的外源基因為靶基因，例如常見的目的基因、標記基因和抗性基因（CP、RP、GUS、NPTⅡ）。對于轉基因番木瓜，除了華農一號轉入的是RP基因外，其他轉基因番木瓜轉入的都是CP基因，未見關于NOS-P和CP基因檢測引物篩選和驗證的相關報道。因此，本研究對轉基因番木瓜CP基因和NOS-P分別進行序列比對，在其保守序列上設計引物，擴大檢測的覆蓋范圍，更好地執行轉基因生物標識制度。

目前，中國的轉基因檢測方法大部分是通過定性PCR方法對轉基因生物進行判定，部分檢測引物存在特異性差、靈敏度低的問題。加之，瓊脂糖凝膠電泳分離技術的局限性，這就要求制定檢測標準和篩選PCR檢測引物的科研人員，不能僅停留在原有的篩選定性PCR引物上，需要向科學化、實用化的方向進行驗證。本研究通過定量PCR染料法，對CP基因和NOS-P的定性檢測引物進行熔解曲線分析，對篩選到的引物進行特異性驗證，檢測結果與姜大剛等、Wall等、韓建勛等描述的質粒載體結構相同。同時，以5種不同相對含量的轉基因番木瓜為對照，檢測靈敏度可以達到0.1%水平。

綜上所述，本研究建立的轉基因番木瓜檢測引物篩選方法，為現有商業化轉基因番木瓜的外源基因和元件篩查檢測奠定了基礎。同時，也構建了轉基因番木瓜的基礎檢測體系與方法，為轉基因番木瓜標識制度的順利執行提供了技術支撐。但是，隨著轉基因番木瓜轉化事件的逐漸增多，現有檢測方法也存在著檢測參數多、操作繁瑣、靈敏度低等缺點。因此，需要逐步建立起各種轉基因番木瓜轉化事件定性和定量的檢測體系，滿足未來監管的需要。