HPLC—DAD測定仙鶴草配方顆粒中3種成分

李軍山 聶麗建

摘要：為了建立同時測定仙鶴草配方顆粒中蘆丁、槲皮苷、木犀草素含量的有效方法，通過對流動相、檢測波長、提取溶劑及提取方式等因素進行考察，最終確定了采用HPLC-DAD法同時測定仙鶴草配方顆粒中的3種成分，采用InertSustain AQ-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以乙腈-0.5%醋酸為流動相，流速為0.8 mL/min，檢測波長為360 nm，柱溫為35 ℃。結果表明，蘆丁、槲皮苷、木犀草素分別在0.216～5.410，0.185～4.635，0.147～3.680 μg范圍內呈現良好的線性關系，R2分別為0.999 5，0.999 6和0.999 7，平均回收率（n=6）分別為101.5%，1001%和99.5%。該方法快速準確，專屬性強，可用于仙鶴草配方顆粒的質量控制。

關鍵詞：色譜分析；仙鶴草配方顆粒；蘆丁；槲皮苷；木犀草素；HPLC

中圖分類號：R2841文獻標志碼：Adoi： 10.7535/hbgykj.2018yx04011

仙鶴草（Agrimonia pilosa Ledeb）始載于《本草圖經》，為薔薇科多年生草本植物龍芽草的全草[1]，夏、秋二季莖葉茂盛時采割，常用名為脫力草、龍芽草、石打穿、狼牙草等，主產于浙江、江蘇、湖北，銷往全國并出口；此外，安徽、遼寧、福建、廣東、河北、山東、湖南、云南等地亦產。仙鶴草性平，味苦、澀，具有收斂止血、截瘧、止痢、解毒、補虛等功效，用于咯血、吐血、崩漏下血、瘧疾、血痢、癰腫瘡毒、陰癢帶下、脫力勞傷等癥狀的治療[2-8]。

目前，對于仙鶴草的研究方法不一，有薄層掃描法、紅外光譜和電泳法等，各方法均有優缺點。GU等[9]利用薄層色譜法測定仙鶴草成分，雖時間較短，但操作過程中受環境的影響較大，測定結果的穩定性、重復性較差；李強等[10]利用紅外光譜法對仙鶴草原藥材及其提取物進行了分析與鑒定，但并未對其中具體成分的含量進行測定；還有研究人員分別利用高效液相色譜法-二極管陣列檢測-電噴霧離子化-串聯質譜法和高速逆流色譜法對仙鶴草中的多種活性成分進行了純化分析[11-12]，但利用HPLC法同時測定仙鶴草配方顆粒中多種成分的相關研究尚未見報道。本實驗采用HPLC-DAD法，同時測定仙鶴草配方顆粒中蘆丁、槲皮苷、木犀草素3種成分的含量，以提高仙鶴草配方顆粒的質量標準[13-16]。

1主要儀器與試藥

日本島津LC-20AT、Agilent1260型高效液相色譜儀。

仙鶴草配方顆粒（神威藥業集團有限公司提供，批號分別為15100211，15122111，15122611，16030411，16031411，16032711）；蘆丁（批號為100080-201610）、槲皮苷（批號為111538-201606）、木犀草素（批號為111520-201605）對照品，均購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈（色譜純，天津科密歐試劑有限公司提供）；其他試劑均為分析純。

2方法與結果

2.1色譜條件

色譜柱：InertSustain AQ-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；檢測波長為360 nm，柱溫為35 ℃，流速為0.8 mL/min，流動相梯度洗脫條件見表1。

2.2溶液的配制

2.2.1對照品溶液

精密稱取蘆丁對照品10.73 mg，置于50 mL量瓶中；精密稱取槲皮苷對照品9.27 mg，置于50 mL

量瓶中；精密稱取木犀草素對照品14.72 mg，置于100 mL 量瓶中。加入80%（體積分數，下同）甲醇溶解并稀釋至刻度，作為對照品貯備液。精密量取5 mL，置于同一50 mL量瓶中，用80%甲醇稀釋至刻度，即得。

2.2.2供試品溶液[17-19]

取仙鶴草配方顆粒，研細，稱取約1.00 g，置于具塞錐形瓶中，加入80%甲醇25 mL，精密稱定，超聲30 min，放冷后用80%甲醇補足質量，過濾，取續濾液即得。

2.3專屬性試驗

取上述供試品、對照品和陰性樣品溶液，按照“21”項條件測定，結果見圖1。各成分的理論塔板數（n=5.54（t/w1/2）2，n為理論塔板數，t為相對保留時間，w1/2為半峰寬）及分離度（R=2（t2-t1）/（w1+w2），R為分離度，t1和w1分別為相鄰色譜峰的前一峰的相對保留時間及峰寬，t2和w2分別為相鄰色譜峰的后一峰的相對保留時間及峰寬）見表2。

2.4線性關系考察

取對照品溶液適量，在“2.1”項色譜條件下進樣1，5，10，15，20，25 μL，以進樣量（x，μg）為橫坐標，峰面積（y）為縱坐標進行回歸，得到回歸方程（n=6）如下。

蘆丁：y=1 051.1x-2 027.9（R2=0.999 5）；

槲皮苷：y=904.91x-4 160.9（R2=0.999 6）；

木犀草素：y=4 646x-1 116.8（R2=0.999 7）。

結果表明：蘆丁、槲皮苷、木犀草素在0.216～5410，0.185～4.635，0.147～3.680 μg范圍內呈現良好的線性關系。

2.5精密度試驗

取混合對照品溶液，連續進樣6次，每次10 μL，測定蘆丁、槲皮苷、木犀草素的峰面積，結果見表3，結果表明儀器的精密度良好。

2.6穩定性試驗

取供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下，于0，3，6，12，18，24 h 進樣，進樣量10 μL，測定蘆丁、槲皮苷、木犀草素的峰面積，結果見表4。由表4可以看出，供試品溶液在24 h內穩定。

2.7重復性試驗

精密稱取同一批號樣品6份（批號為14100211），每份0.5 g，按“2.2.2”項方法制備供試品溶液，按照“2.1”項色譜條件測定蘆丁、槲皮苷和木犀草素的峰面積，結果見表5。由表5可以看出，該方法的重復性良好。

2.8加樣回收率試驗

稱取同一批仙鶴草配方顆粒，研細，按“2.2.2”項方法各稱取約1.00 g，平行制備3份樣品，測定各成分含量；再稱取3組9份仙鶴草配方顆粒樣品，各加入一定量的對照品，分別進樣分析，結果見表6。結果顯示，蘆丁、槲皮苷和木犀草素的平均回收率分別為101.5%，100.1%和99.5%。

2.9耐用性試驗

用依利特Sinochrom ODS-BP （250 mm×4.6 mm，5 μm） 和Thermo Sciences BETASIL C18（250 mm ×4.6 mm，5 μm） 色譜柱在2臺高效液相色譜儀（島津LC-20AT和Agilent1260） 上進行耐用性試驗考察，測定其峰面積，結果見表7。結果表明，2個廠家的液相色譜儀和2種色譜柱均可滿足試驗要求，耐用性良好。

2.10樣品含量測定

取6批樣品，按“2.2.2”項方法制備供試品溶液，按照“2.1”項色譜條件測定，結果見表8。

2.11檢測限與定量限

取“2.2.1”項對照品貯備液，逐級稀釋后進樣，以色譜峰峰高為基線噪音3倍進行計算，蘆丁、槲皮苷和木犀草素的檢測限分別為1.460，0.440和1064 ng；以色譜峰峰高為基線噪音10倍進行計算，定量限分別為4.380，1.320和3.192 ng。

3討論

3.1流動相的選擇

蘆丁、槲皮苷和木犀草素的檢測流動相大多采用乙腈-磷酸、醋酸溶液或乙腈-水，也有用甲醇-磷酸溶液、甲醇-冰醋酸或甲醇-水溶液。采用甲醇時，各色譜峰的分離度及峰型對稱情況較差。本實驗對比了乙腈-磷酸水溶液及乙腈-不同濃度的醋酸水溶液，發現以乙腈-0.4%磷酸水溶液為流動相洗脫時，基線不穩且槲皮苷的分離度較低；以乙腈-水為流動相時，色譜峰個數減少；以乙腈-0.5%醋酸水溶液為流動相時，4種被測成分都能得到很好的分離。故本實驗以乙腈-0.5%醋酸水溶液為流動相，采用梯度洗脫方式，使3種成分均有合適的保留時間和較高的分離度。

3.2檢測波長的選擇

通過對對照品溶液進樣分析的全波長掃描圖進行分析，發現蘆丁在255 nm和354 nm波長處有較大吸收，槲皮苷在255 nm和349 nm波長處有較大吸收，木犀草素在252 nm和348 nm波長處有較大吸收，3種成分的全波長掃描圖見圖2。綜合考慮，本實驗選擇360 nm作為檢測波長，色譜圖基線平穩，雜峰少，各成分均有較高響應，在上述實驗條件下定量準確，回收率較高。

3.3提取方法的選擇

本實驗考察了超聲提取、索氏提取、回流提取等方式，研究了回流時間和超聲時間。結果顯示，3種提取方法差異較小，超聲時間小于20 min時測定結果偏低，而在30 min以上時較為穩定。因此，選擇超聲30 min作為提取方法。

3.4提取溶劑的選擇

用純甲醇、乙醇、水及不同比例的甲醇溶液作為提取溶劑進行實驗，發現純甲醇對極性較大的成分提取效果差，乙醇對各種成分的提取效果均不佳，水對極性較小成分的提取效果差，40 min后出峰成分提取效率極低，20%的甲醇對40 min后出峰的成分提取效果亦不佳。對比分析50%和80%甲醇作為提取溶劑的提取效果，發現80%甲醇提取的蘆丁、槲皮苷、木犀草素的峰型及分離度最好、基線最優。因此，最終確定以80%的甲醇作為提取溶劑。

4結語

利用HPLC法同時測定仙鶴草配方顆粒中的多種成分目前尚未見報道。本實驗通過對流動相、檢測波長、提取溶劑及提取方式等進行考察，最終確定了采用HPLC-DAD法同時測定仙鶴草配方顆粒中的3種成分，以乙腈-0.5%醋酸為流動相，流速為0.8 mL/min，檢測波長為360 nm，柱溫為35 ℃。結果表明，蘆丁、槲皮苷、木犀草素分別在0.216～5410，0.185～4.635，0.147～3.680 μg范圍內呈現良好的線性關系，R2分別為0.999 5，0.999 6和0999 7，平均回收率（n=6）分別為101.5%，1001%和99.5%。該方法快速準確，專屬性強，可用于仙鶴草配方顆粒的質量控制。

仙鶴草中含有蘆丁、花旗松素、香豆素、木犀草素、山奈酚和芹菜素等多種黃酮類成分，此類成分具有抗心律失常、抑制乙酰膽堿酯酶、降糖等多種藥理作用。本文僅對3種成分進行了同時測定，未來應繼續深入研究仙鶴草配方顆粒中的其他黃酮類成分，以保證臨床療效。

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