溫腎健脾方對重癥肌無力患者免疫功能的影響

張麗香 郭全 郭遠瑾 韋俊杰 李呂力 鐘維章 藺心敬 李燕華 李曉峰

〔摘要〕 目的 觀察溫腎健脾方對重癥肌無力（MG）脾腎陽虛型患者外周血B淋巴細胞亞群、白細胞介素-6（IL-6）、B淋巴細胞活化因子（BAFF）表達的影響。方法 入選脾腎陽虛型MG患者18例為觀察組，同期健康體檢者20例為正常對照組，采用ELISA法檢測治療前、治療后IL-6、BAFF的水平，采用流式細胞術檢測治療前、后外周血B淋巴細胞亞群比率。結果 MG患者IL-6、BAFF表達明顯高于正常對照組（P<0.01），溫腎健脾方治療1月后，MG患者IL-6、BAFF水平明顯下降，差異有統計學意義（P<0.01）；MG患者治療前、后CD19+CD27+細胞百分比分別為（1.04±0.24）%、（0.96±0.28）%，差異無統計學意義（P>0.05），CD19+CD27-細胞百分比分別為（3.02±1.12）%、（2.12±0.42）%，差異有統計學意義（P<0.05）。結論 溫腎健脾方對MG患者有一定的免疫調節作用，其機制可能與降低外周血中未分化B淋巴細胞數量及BAFF、IL-6水平有關。

〔關鍵詞〕 重癥肌無力；溫腎健脾方；B淋巴細胞亞群；IL-6；BAFF

〔中圖分類號〕R256.3；R746.1 〔文獻標志碼〕B 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2018.04.024

〔Abstract〕 Objective To observe the effect of Wenshen Jianpi decoction on the immunologic function in spleen-kidney yang deficiency patients with myasthenia gravis. Methods 18 MG patients with spleen-kidney yang deficiency were selected as observation group and 20 healthy subjects were selected as normal control group in the same period. The levels of BAFF and IL-6 were measured by ELISA and the percentage of B lymphocyte subsets in peripheral blood was detected by flow cytometry before and after treatment. Results The expression of IL-6，BAFF in MG patients were significantly higher than the normal control group （P<0.01）. After Wenshen Jianpi decoction treatment for 1 month， the levels of IL-6 and BAFF in MG patients decreased significantly （P<0.01）. The percentage of CD19+CD27+ cells before and after treatment were （1.04±0.24）%， 0.96±0.28）%， the percentage of CD19+CD27- cells before and after treatment were （3.02±1.12）%，（2.12±0.42）%， the differences were ststistically significant（P<0.05）. Conclusion Wenshen Jianpi decoction has exact effects on immune regulation in patients with myasthenia gravis， and the mechanism may be related to reducing the number of undifferentiated B lymphocytes and the levels of BAFF and IL-6 in peripheral blood.

〔Keywords〕 myasthenia gravis； Wenshen Jianpi decoction； B lymphocyte subsets； IL-6； BAFF

重癥肌無力（myasthenia gravis， MG）是一種乙酰膽堿受體抗體介導、細胞免疫依賴、補體參與、以神經-肌肉接頭傳遞功能障礙為特征的獲得性自身免疫性疾病。目前西醫多采用膽堿酯酶抑制劑、腎上腺皮質激素、免疫抑制劑、靜脈注射免疫球蛋白、免疫吸附、血漿置換等治療，外科多采用胸腺切除法以及造血干細胞移植療法，治療方法雖多，但是副作用較大。既往的臨床觀察發現全身型MG患者多具有脾腎陽虛癥狀為主的中醫癥候特點[1-2]，在此基礎上，本研究應用ELISA法檢測脾腎陽虛型MG患者外周血白細胞介素-6（lnterleukin 6，IL-6）、B淋巴細胞活化因子（b-cell activating factor，BAFF）水平，流式細胞術檢測B淋巴細胞亞群分布變化，探討溫腎健脾方對MG患者的免疫調節作用機制。

1 資料與方法

1.1 觀察對象

MG病例來源系廣西壯族自治區人民醫院2010年10月至2013年10月期間神經內科門診及住院患者，根據中國神經免疫學會診斷標準[3]確診MG；按照中醫脾腎陽虛癥候：眼瞼下垂，復視，咀嚼、抬頸無力，四肢倦怠無力，畏寒肢冷，吞咽困難，面色白，腹部冷痛，久泄久痢或便溏、完谷不化，小便清長，或浮腫少尿，舌淡胖，苔薄白或白滑，脈沉遲無力或脈沉細，入選脾腎陽虛型新發病MG患者18例，按照改良Osserman臨床分型[4]，Ⅱa型5例、Ⅱb型13例；排除激素、免疫抑制劑治療史以及其他自身免疫性疾病，其中男6例，女12例，年齡（35.6±8.4）歲。對照組為同期健康體檢者20例，其中男8例，女12例，年齡（34.2±9.4）歲，無自身免疫性疾病，近期內未服用影響免疫功能藥物。兩組性別、年齡、民族差異無統計學意義（P>0.05），所有受檢者均知情同意研究內容后納入。

1.2 治療方法

（1）溴吡啶斯的明：根據患者病情嚴重程度，分別從60 mg每日3次至120 mg每日4次，長期規律口服；（2）中藥治療： 患者經中醫辨證診斷后口服溫腎健脾方（補中益氣湯、金匱腎氣湯加減）：黃芪60 g，黨參30 g，白術15 g，當歸15 g，陳皮15 g，柴胡15 g，升麻15 g，熟地黃15 g，山萸肉25 g，菟絲子25 g，山藥15 g，牛膝10 g，制附子3 g，丹皮6 g，澤瀉6 g，鹿角12 g，巴戟25 g，甘草6 g。每日1劑，療程1個月。

1.3 觀察指標及方法

治療前、治療1月后分別檢測患者外周血IL-6、BAFF水平及B淋巴細胞亞群比率。

1.3.1 IL-6、BAFF水平測定 所有受試者均于清晨空腹采血6 mL，其中1 mL離心取上清，置于EP管內-80 ℃保存，采用雙抗體夾心酶聯免疫吸附法（ELISA）對所有標本一次性進行測定，所有試劑盒均由Rapidbio Lab提供，嚴格按照試劑盒說明書要求程序進行操作。酶標儀（GF-M3000型酶標儀）450 nm 處測A值，繪制標準曲線，計算BAFF和IL-6濃度值。

1.3.2 B淋巴細胞亞群比率測定 受試者靜脈血5 mL，置于肝素鈉抗凝管，加入等倍磷酸鹽緩沖液（PBS）稀釋，緩慢加于人淋巴細胞分離液之液面上，以3 000 r/min離心15 min，收集第二層細胞（淋巴細胞），1% PBS反復洗滌2次，計數后取100 μL細胞懸液加入相關表面抗體及同型對照抗體5 μL，4 ℃避光孵育30 min，常溫下用2 mL 1%PBS洗2次，加入300 μL 1%多聚甲醛固定，4 h內行流式細胞儀檢測。上機收集1×104個細胞，使用Cell Quest軟件分析陽性細胞百分率。

1.4 統計學處理

采用SPSS 13.0統計學軟件對數據進行統計分析，計量資料以“x±s”表示，治療前后進行配對t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組MG患者外周血IL-6和BAFF水平

治療前脾腎陽虛型MG患者外周血中IL-6、BAFF的水平明顯高于對照組，差異有統計學意義（P<0.01），溫腎健脾方治療1月后，MG患者IL-6、BAFF水平均明顯下降（P<0.01），見表1。

2.2 兩組MG患者溫腎健脾方治療前后B淋巴細胞亞群的表達

治療前脾腎陽虛型MG患者外周血CD19+CD27+細胞表達及CD19+CD27-細胞表達明顯高于對照組（P<0.01），溫腎健脾方治療后CD19+CD27+細胞表達較治療前略下降，但差異無統計學意義（P>0.05）；CD19+CD27-細胞表達較治療前明顯下降，差異有統計學意義（P<0.05）。見表2。

3 討論

MG主要臨床表現為骨骼肌無力、易疲勞、晨輕暮重，活動后加重，休息后或服用膽堿酯酶抑制劑后減輕等特點。中醫學并無重癥肌無力病名診斷，根據該病臨床表現歸屬中醫“萎證”范疇。病位在脾腎肝，以虛多見。脾主運化，主肌肉，脾虛則運化和散精功能失常，水谷精微內不能供養五臟六腑，外不能濡養肌肉關節；腎主藏精，主生長發育，腎虛則臟腑功能減退，筋骨痿軟乏力。根據國內文獻報道[5]，應用補中益氣湯治療MG取得較好的臨床療效，但具體機制尚不清楚。

脾腎陽虛證型是臨床全身型MG最常見病證類型，常發生于MG發病進程中。根據脾腎陽虛的病機特點，當循“虛者補之”“損者益之”，治法以健脾益腎為主，在補益脾胃藥中加溫補腎陽之品。《黃帝內經》提出“治痿獨取陽明”，在此基礎上后世醫家對痿證的病因、病機研究更加深入，北宋時期的竇材將痿證的發病歸之于腎，提出溫補腎陽、壯火起痿等治法，明代《普濟方》記載了金剛丸、牛膝丸等治療“肝腎不足”之痿證。溫腎健脾方源自補中益氣湯、金匱腎氣湯加減而成，方中黃芪、黨參、茯苓、甘草、白術、山藥、陳皮健脾益氣，柴胡、升麻升陽舉陷，鹿角、巴戟天、制附子、菟絲子、牛膝、山萸肉溫補腎陽，熟地黃、丹皮、澤瀉滋補肝腎陰虛。縱觀全方，共奏健脾益氣、溫補腎虛之效。

人體外周血中B細胞亞群主要為未活化的未成熟B細胞、初始B細胞以及活化的記憶性B細胞、漿母細胞[6]。CD19+CD27-細胞標記了未活化的未成熟B細胞及初始B細胞，而CD19+CD27+細胞標記了活化的記憶性B細胞及漿母細胞。既往研究發現[7-8]，BAFF主要表達在單核細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞、生長因子刺激的中性粒細胞和活化的T細胞表面，BAFF信號對T淋巴細胞的活化發揮著共刺激作用。BAFF過度表達可以導致B細胞嚴重增生、降低B細胞的耐受性，促進體內自身抗體產生，產生自身免疫反應[9]。II-6可促進B細胞增殖、分化和分泌抗體，在活化、增殖的B細胞分化為漿細胞的過程中起關鍵作用。既往的研究中發現，新發病MG患者，尤其是Ⅱb型和Ⅲ型患者中，IL-6、BAFF表達一致性增高[10]。Dalakas等[11-12]研究也證實，MG患者BAFF表達明顯增高，T、B淋巴細胞在MG發病中具有協同作用， 控制B淋巴細胞的功能異常是治療MG的關鍵。國內研究表明[13]，以黃芪、黨參、茯苓、甘草、白術為主的健脾益氣為主的中藥，有助于抑制B淋巴細胞代謝和增殖，具有調節體液免疫功能。本研究發現，脾腎陽虛型MG患者外周血CD19+CD27-細胞及BAFF表達明顯增高，提示MG患者體內存在B細胞亞群功能紊亂，由于CD19+CD27-細胞代表未活化B細胞，BAFF能促進B細胞活化增殖，并延緩其凋亡，MG患者體內未活化B細胞增高可能是由于BAFF表達增加所致，這些增多的未活化B細胞會進一步被激活為活化B細胞，參與MG的發病；以補中益氣湯為基礎的溫腎健脾方能夠降低MG患者CD19+CD27-細胞及BAFF、IL-6表達水平，但CD19+CD27+細胞的表達在治療前后無明顯變化，由于MG患者免疫功能障礙機制復雜，抑制未活化B細胞表達并不能完全糾正患者體內的免疫功能紊亂。Lebrun等[14]研究發現，利妥昔單抗能有效抑制MG的復發，通過監測重新出現的CD27+記憶B細胞，可安全降低利妥昔單抗給藥頻率。提示MG患者外周血CD27+細胞亞群的作用仍需進一步探討。

綜上所述，脾腎陽虛型MG患者存在以CD19+CD27-細胞及BAFF表達增高為特征的免疫功能紊亂，溫腎健脾方可能通過抑制BAFF、IL-6的表達，降低未活化B細胞的比率，從而發揮對MG的免疫調節作用。

參考文獻：

[1] 李曉峰，李呂力，羅永堅，等.重癥肌無力患者IL-18、TGFβ-1的表達[J].中國神經精神疾病雜志，2010，36（7）：393-396.

[2] 呂志國，王 健，徐 鵬，等.基于專家共識法的重癥肌無力中醫證候篩選研究[J].世界科學技術：中醫藥現代化，2017，19（1）：1-6.

[3] 李柱一，許賢豪，劉建軍，等.第八屆全國神經免疫會議紀要[J].中華神經科雜志，2005，38（2）：128.

[4] 陳灝珠.實用內科學[M].北京：人民衛生出版社，2002：2490-2493.

[5] 蔣旭宏，黃小民，章正祥，等.裘昌林教授治療重癥肌無力的用藥規律探究[J].中國中醫急癥雜志，2016，25（3）：428-432.

[6] KOHLER S， KEIL T O， SWIERZY M， et al. Disturbed B cell subpopulations and increased plasma cells in myasthenia gravis patients[J]. J euroimmunol，2013，264（1-2）：114-119.

[7] KANG S Y， KANG C H， LEE K H. B-cell-activating factor is elevated in serum of patients with myasthenia gravis[J]. Muscle Nerve，2016，54（6）：1030-1033.

[8] LISAK R P， RAGHEB S. The role of B cell-activating factor in autoimmune myasthenia gravis[J]. Ann N Y Acad Sci，2012，1274（1）：60-67.

[9] COMABELLA M. Neuroimmunology： B cells and variant BAFF in autoimmune disease[J]. Nat Rev Neurol，2017，13（8）：453-454.

[10] 李曉峰，李呂力，羅永堅，等.重癥肌無力患者血清B淋巴細胞刺激因子、IL-6水平檢測及臨床意義[J].中國老年學雜志，2010，30（14）：1938-1939.

[11] DALAKAS M C. Novel future therapeutic options in myasthenia gravis[J]. Autoimmun Rev， 2013，12（9）：936-941.

[12] BERRIH-AKNIN S， RAGHEB S， LE PANSE R， et al. Ectopic germinal centers， BAFF and anti-B-cell therapy in myasthenia gravis[J]. Autoimmun Rev，2013，12（9）：885-893.

[13] 吳玉霞，黃志惠，袁 忠，等.健脾益氣攝血顆粒對脾氣虛型慢性免疫性血小板減少癥淋巴細胞亞群的影響[J].湖南中醫藥大學學報，2016，36（9）：65-68.

[14] LEBRUN C， BOURG V， BRESCH S， et al. Therapeutic target of memory B cells depletion helps to tailor administration frequency of rituximab in myasthenia gravis[J]. J Neuroimmunol， 2016，298：79-81.