3種越橘桔莖尖初代培養與增殖研究

范世杰 楊忠華 尹文龍

摘要： 以紅豆越橘、篤斯越桔和美登的莖尖為試材，對影響莖尖離體培養的取材時期、外植體的消毒、培養基和激素配比等因素進行研究的結果表明：休眠期水培促萌的嫩芽污染率較低，最利于莖尖誘導成活。適于滅菌的處理為：紅豆越橘用75%酒精30 s+0.1%升汞2 min+次氯酸鈉4 min;篤斯越桔和美登用75%酒精滅菌30 s+0.1%升汞滅菌處理4 min+次氯酸鈉滅菌2 min。適于莖尖初代培養的培養基組合為：紅豆越橘用WPM（改良）+6-BA 0.05 mg/L+IBA 0.5 mg/L+GA3 0.1 mg/L，誘導成苗率最高達84.42%;篤斯越桔、美登用WPM（改良）+6-BA 0.1 mg/L+IBA 0.5 mg/L+GA3 0.1 mg/L，成苗率分別為83.44%、92.76%。適合的增殖培養基組合為：紅豆越橘、篤斯越桔用WPM（改良）+ZT 1.0 mg/L+GA3為0.1 mg/L，增殖系數分別為3.90、3.72，苗高分別為2.66、2.51 cm;美登用WPM（改良）+ZT 1.2 mg/L+GA3 0.2 mg/L，增殖系數為4.59，苗高達到2.74 cm。

關鍵詞： 紅豆越橘; 篤斯越桔; 莖尖培養; 激素; 培養基; 增殖

中圖分類號： S 722. 8， S 665. 9 文獻標識碼： A

組織培養以其培養周期短、繁殖系數高等優點成為了快速繁殖優良苗木的實用技術，目前已被廣泛應用于農、林業等領域[ 1 - 4 ]。而莖尖培養技術是培育無病毒植株、種質資源保存、育種以及遺傳轉化等研究的有效手段[ 5 - 7 ]。 研究表明，影響植物微莖尖培養的因子主要有樹種和品種[ 8 ]、取材及接種時期[ 9 ]、外植體的消毒[ 10 ]、培養基、激素[ 11 - 13 ]以及培養條件等。關于越橘、篤斯越桔以及藍莓栽培種“美登”的組織培養已有大量報道[ 14 ]，以往主要是以葉片[ 15 ]、子葉、胚軸、腋芽和莖段[ 16 - 17 ]等為外植體，并建立了相應的組培快繁體系，而對莖尖組織培養缺乏系統的研究。因此，本研究以紅豆越橘（Vaccinium vitis-idaea）、篤斯越桔（Vaccinium uliginosum）以及美登為試驗材料，在不同生長期對其莖尖進行取材，對影響莖尖誘導的主要因子進行研究，旨在為3種越橘莖尖離體快繁、無病毒苗培育提供技術支撐。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

紅豆越橘、篤斯越桔材料來源于大興安嶺漠河，美登材料來源于伊春。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 取材時期對莖尖誘導的影響

分以下幾個時期進行取材：（處理1）取休眠期枝條于溫室內水培催芽，滅菌后接種;（處理2）取新梢生長初期枝條的頂端新萌發嫩芽，滅菌后接種;（處理3）取新梢生長中期的頂端嫩枝莖尖，滅菌后接種;（處理4）取盛花期的枝條頂端莖尖，滅菌后接種;（處理5）取秋季休眠前的枝條頂端莖尖，滅菌后接種。

1. 2. 2 消毒劑和消毒時間對莖尖誘導的影響

取頂端嫩芽放入組培瓶中，滴2滴洗潔精，在自來水下沖洗30 min，然后在超凈工作臺上，用75%的乙醇溶液消毒30 s，再用無菌水沖洗2次，分別轉到0.1%升汞、2%次氯酸鈉溶液中滅菌處理2、4、6 min，然后用無菌水沖洗4～5次，最后用無菌濾紙吸干表面水分備用。

1. 2. 3 激素對莖尖誘導的影響

在解剖鏡下剝取0.5 mm大小的莖尖迅速接種于改良的WPM（分別用708 mg/L的 Ca（NO3）2·4H2O、202 mg/L的KNO3代替 WPM 培養基中的 CaCl2和K2SO4）培養基上，培養基中分別添加0.05、0.1、0.5 mg/L的6-BA或ZT，添加0.1、0.5、1.0 mg/L的IBA，添加0.1 mg/L的GA3。每個處理接種30個莖尖，每個處理重復3次。蔗糖 20 g/L，瓊脂 6 g/L，pH 值 5.4，培養溫度均為（23± 2）℃ ，光照培養周期為 14 h/d，光照強度為 2 200 Lx，其他試驗的條件均與此相同。

1. 2. 4 培養基對莖尖增殖的影響

分別以MS、WPM、WPM（改良）為基本培養基，培養基中分別添加1.0 mg/L的ZT和0.1 mg/L的GA3，將初代培養存活的莖尖接種到培養基上。

1. 2. 5 激素對莖尖增殖的影響

將初代培養存活的莖尖接種到WPM（改良）培養基上，培養基中分別添加0.5、0.8、1.0、1.2、1.5、2.0 mg/L的ZT，添加0.1 、0.2 mg/L的GA3。

1. 2. 6 數據統計分析

接種1周后統計污染率，45天左右統計成苗率，30天統計莖尖苗增殖系數及苗高。

2 結果與分析

2. 1 取材時期對莖尖誘導的影響

由表1可見，處理1～5污染率呈升高趨勢，而莖尖誘導成苗率呈下降趨勢。處理1與其他處理相比有一定差異，3種越橘污染率均值較低，為6.94%;莖尖誘導成苗率均值較高，為85.52%，這個階段為最適宜取材時期。處理2污染率均值高于處理1，莖尖誘導成苗率均值與處理1無顯著差異，與處理4、5差異顯著。處理3污染率均值達到50%以上，成苗率均值為67.63%。處理4和處理5污染率均值較高，分別為77.42%和91.43%，莖尖誘導成苗率均值較低，分別為35.8%和11.02%。由此可見，不同取材時期莖尖污染率和誘導成苗率有很大的差異。

3種越橘的不同取材時期污染率和成苗率也存在一定的差異。休眠期取枝條室內水培催芽，美登的莖尖污染率最低、成苗率最高，分別為5.62%和90.31%。在新梢生長初期取材， 美登比紅豆越橘和篤斯越桔莖尖成苗率高，為82.47%，篤斯越桔的污染率最低為18.77%。在新稍生長中期取材，紅豆越橘莖尖的污染率最低、成苗率最高，分別為42.41%和71.75%。而在盛花期和秋季休眠前取材，3種越橘莖尖的成苗率均較低，不到50%，而污染率均在70%以上。對5個取材時期結果進行綜合評價得出，污染率由低到高依次為休眠期枝條于溫室內水培催芽<新梢生長初期枝條的頂端新萌發嫩芽<新梢生長中期的頂端嫩枝莖尖<盛花期的枝條莖尖<秋季休眠前的枝條頂端單芽莖尖。莖尖成苗率由高到低依次為美登藍莓﹥紅豆越橘﹥篤斯越桔。在休眠期和新稍生長初期取材，3種越橘莖尖污染率相對較低，誘導成苗率較高。

2. 2 消毒劑和消毒時間對莖尖誘導的影響

由表2可見，75%乙醇與0.1%升汞、2%次氯酸鈉分別配合使用時，隨著處理時間的增加，污染率均值呈下降趨勢，而莖尖誘導成苗率均值呈先上升后下降的趨勢。同樣處理時間下，升汞與次氯酸鈉相比，莖尖污染率較低，誘導成苗率較高，滅菌效果較好。

將75%乙醇與升汞、次氯酸鈉共同配合使用，滅菌效果有所不同。紅豆越橘15個處理中以處理9效果最好，即先用75%酒精滅菌30 s，再用0.1%升汞滅菌處理2 min，最后用次氯酸鈉滅菌處理4 min，污染率和成苗率分別為4.65%和84.27%。篤斯越桔15個處理中以處理6效果最好，即先用75%酒精滅菌30 s，再用0.1%升汞滅菌處理4 min，最后用次氯酸鈉滅菌處理2 min，污染率和成苗率分別為1.85%和78.41%。美登15個處理中以處理6效果最好，即先用75%酒精滅菌30 s，再用0.1%升汞滅菌處理4 min，次氯酸鈉滅菌處理2 min，污染率和成苗率分別為2.40%和81.44%。

2. 3 不同激素對莖尖誘導的影響

將3種越橘莖尖接種到培養基上，10天左右莖尖泛綠，但3種越橘莖尖在含有激素ZT的培養基上基部多數形成愈傷組織，成苗較晚，成苗率相對較低。由表3可見，紅豆越橘不同處理間莖尖成苗率存在顯著差異，當6-BA為0.05 mg/L、IBA為0.5 mg/L、GA3為0.1 mg/L時，誘導成苗率最高，達84.42%;篤斯越桔不同處理間莖尖的成苗率也存在顯著差異，當6-BA為0.1 mg/L、IBA為0.5 mg/L、GA3為0.1 mg/L時，成苗率最高，為83.44%;美登不同處理間達到差異顯著水平，當6-BA為0.1 mg/L、IBA為0.5 mg/L、GA3為0.1 mg/L時，更利于莖尖生長，成活率可達到92.76%。不同品種莖尖生長狀況有一定的差異，美登在不同激素條件下誘導成苗率要高于其他兩個品種，生長更為健壯。

2. 4 培養基種類對莖尖增殖的影響

由表4可見，紅豆越橘、篤斯越桔、美登由莖尖誘導的苗分別接種到3種培養基上后，在WPM（改良）培養基上增殖系數最高，均值為3.58，苗高均值為2.78 cm，且苗較健壯，接種到WPM培養基上生長次之，而接種到MS培養基上生長最差。同一種越橘在不同培養基上的增殖系數、苗高均有不同差異，紅豆越橘、篤斯越桔、美登莖尖在WPM（改良）培養基上的增殖系數和平均苗高均較高，增殖系數分別為3.58、3.16和4.09，平均苗高分別為2.61、2.75和2.98 cm。因此從增殖系數、平均苗高等進行綜合評價，WPM（改良）培養基為3種越橘莖尖苗增殖的最佳培養基。

2. 5 激素對不同品種莖尖增殖的影響

將3種越橘莖尖誘導的苗接種到增殖培養基上進行培養， ZT濃度對莖尖苗增殖系數影響較大，不同處理間增殖系數有一定差異。由表5可見，紅豆越橘不同處理間莖尖苗增殖存在顯著差異，當ZT濃度為1.0 mg/L、GA3為0.1 mg/L時，增殖系數最高達3.90，苗高為2.66 cm;篤斯越桔不同處理間莖尖苗也存在顯著差異，當ZT濃度為1.0 mg/L、GA3為0.1 mg/L時，增殖系數最高達3.72，苗高也能達到中等水平，為2.51 cm;對于美登各處理間達到差異顯著，當ZT濃度為1.2 mg/L、GA3為0.2 mg/L時，更利于莖尖苗增殖，增殖系數可達4.59，苗高達到2.74 cm。不同越橘莖尖生長狀況有一定的差異，美登增殖能力要高于其他2種越橘，生長也更為健壯。

3 結論與討論

3. 1 取材時期對莖尖污染率、誘導成活率影響較大。紅豆越橘、篤斯越桔和美登在休眠期室內水培后萌發出的嫩芽污染最低，這個階段可顯著降低接種的污染率，提高莖尖誘導成苗率，為最適宜取材時期。新梢生長中期、盛花期以及秋季休眠前的枝條頂端莖尖，由于長時間暴露在室外，接種污染率較高，莖尖分生組織分化相對緩慢，莖尖誘導成苗率也較低，應盡量避免在這些時期取材。

3. 2 在莖尖培養過程中，培養基是影響莖尖成活率以及苗木狀態的主要因素之一，紅豆越橘、篤斯越桔和美登在WPM（改良）培養基上增殖系數大、生長健壯，在MS培養基上生長最差，莖尖誘導成苗率也較低。

3. 3 植物激素是影響莖尖誘導和增殖的關鍵因子之一，在組織培養中起著重要作用[ 18 ]。對3種越橘的研究表明，在莖尖誘導成苗過程中6-BA和IBA起著主要作用。在莖尖苗增殖過程中ZT起著關鍵的作用[ 19 - 20 ]，ZT濃度在0.5～2.0 mg/L的范圍內3種越橘莖尖苗的增殖系數均呈先升高后下降的趨勢，不同種的越橘達到最高增殖系數時所需的ZT濃度不同。當ZT濃度高于0.8 mg/L時，愈傷組織并未發生玻璃化現象，這與趙新宇（2015）[ 17 ]對藍莓的研究結果一致，與劉樹英（2002）[ 21 ]對兔眼越橘的研究不同。

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第1作者簡介： 范世杰（1963-）， 男， 高級工程師。

收稿日期： 2018 - 03 - 20

（責任編輯： 張亞楠）