芳伯胺染料/甲醛復合修飾蠶絲的結構性能研究

鄭金平 陳維國 崔志華 江華 高普 孫巖峰

摘要： 基于三組分Mannich反應蛋白質修飾的基本原理，采用自制的芳伯胺染料作為修飾顯色劑的手段，文章研究了芳伯胺染料/甲醛復合對蠶絲素蛋白發生共價鍵合修飾的同時，甲醛與蠶絲素蛋白氨基酸殘基反應形成交聯產物及其對蠶絲結構及性能的影響，為實現蛋白質材料功能化的修飾提供一定的理論依據。采用以氨基酸模擬蠶絲氨基酸殘基與甲醛的反應，通過質譜和紅外光譜等分析手段，表征了甲醛與蠶絲素蛋白中氨基酸殘基之間的交聯作用。通過測定蠶絲的斷裂強力、斷裂伸長、折皺回復角等物理指標，進一步揭示了甲醛與蛋白質氨基酸殘基發生交聯對蠶絲織物性能的影響。

關鍵詞： 芳伯胺；染料；蠶絲；醛；交聯；結構

中圖分類號： TS190.2文獻標志碼： A文章編號： 1001-7003（2018）03-0007-08引用頁碼： 031102

Abstract： Based on the basic principle of three-component Mannich reaction protein modification， the self-made aromatic primary amine dye was used as the color developing reagent. In this paper， aromatic amine dye/formaldehyde complex was covalently bonded to silk fabric. In addition， the cross-linking products formed by the reaction of formaldehyde solution with amino acid residues and their effects on the structure and properties of silk were studied to provide some theoretical basis for the realization of functionalization of protein material. Amino acid was applied to simulate the reaction of protein amino acid residues and formaldehyde. The cross-linking function between formaldehyde and amino acid residue in the protein was characterized by mass spectra and infrared spectroscopy. By measuring the tensile strength， elongation at break and wrinkle recovery angle of silk fabrics， the influence of cross-linking between formaldehyde and amino acid residue in the protein on silk fabric properties was further revealed.

Key words： aromatic primary amine； dye； silk； formaldehyde； cross-linking； structure

蛋白質的化學修飾是通過引入部分取代基或功能片段，以實現蛋白質材料功能化的手段。自20世紀50年代以來，蛋白質化學修飾獲得了越來越多的關注和投入，其研究領域越來越寬。近年來，相繼有不少報道介紹了有關蛋白質化學修飾的研究進展[1-2]。

Mannich反應是將含有活潑氫的化合物與甲醛和二級胺或氨縮合，生成β-氨基（羰基）化合物的有機化學反應。Mannich反應在化學合成、醫藥制備等方面有著廣泛的用途。Joshi等[3]發現芳胺類物質可以通過Mannich反應高選擇性地修飾蛋白質的酪氨酸殘基。根據這個原理，本課題組合成了含芳伯胺的染料作為修飾顯色劑，嘗試將芳伯胺染料/醛組份復合對蠶絲素蛋白進行Mannich反應修飾，以期借助含芳伯胺染料作修飾顯色劑，直觀地表征該修飾的發生和效率[4]。然后，采用非質子性極性溶劑N，N-二甲基甲酰胺（DMF）具有對染料和染色物之間離子鍵結合的剝離作用，可以進一步驗證芳伯胺染料/醛組分復合對蠶絲修飾的共價鍵結合作用[5]。

芳伯胺染料/醛組分復合修飾蠶絲的反應分兩個階段進行：第一階段，醛類先和芳伯胺染料反應失去一分子水，形成席夫堿；第二階段，形成的席夫堿和蠶絲上的酪氨酸殘基發生親電取代反應，以共價鍵的形式和蠶絲連接在一起。該蛋白質修飾反應機理如圖1所示。

甲醛作為活潑的小分子醛類試劑，在藥學和分子生物學領域蛋白質的化學修飾方面得到了廣泛應用。甲醛能夠快速地滲透細胞膜，參與細胞內蛋白質交聯。可以看到，甲醛不僅能夠與芳伯胺染料、蠶絲素蛋白反應實現Mannich反應修飾，還能夠參與氨基酸殘基（氨基）或端位之間的交聯反應，從而形成復雜的、網絡狀的蛋白質交聯產物[6-7]（圖2）。

本文基于Mannich反應基本原理，利用自制的芳伯胺染料作為修飾物和修飾顯色劑，對蠶絲進行修飾和顯色表征。并針對Mannich反應修飾之外，甲醛與氨基酸殘基反應形成的交聯產物及其對蠶絲結構及性能的影響進行研究。通過測定蠶絲的斷裂強力、斷裂伸長率、折皺回復角等物理指標，揭示甲醛與蛋白質氨基酸殘基的交聯對蠶絲織物性能的影響；同時選用氨基酸（色氨酸及精氨酸）模擬蠶絲的氨基酸殘基與甲醛的反應，借助質譜和紅外光譜等手段，表征甲醛處理后蠶絲的化學結構變化。

1實驗

1.1材料與儀器

織物：11205電力紡練白蠶絲綢，平方米質量為40g/m2（喜得寶絲綢有限公司）。

化學試劑：冰醋酸、醋酸鈉、甲醛水溶液（37.0%～40.0%）、乙酰丙酮為分析純試劑，商品酸性橙Ⅱ為工業樣品（龍光化工有限公司），芳伯胺橙色染料D3為自制品[4]（圖3）。

儀器：US560-02振蕩染色機（佛山市容桂瑞邦機電設備廠），SF600-PLUS測色配色儀、LCQ Fleet質譜儀（美國Thermo公司），Nicolet Avator 170傅立葉紅外光譜儀（美國Nicolet公司），Cary40紫外/可見分光光度計（美國Varian公司）。

1.2測試方法

1.2.1芳伯胺染料/甲醛復合處理蠶絲實驗

染色條件：染料2%，溫度30℃，染料︰醛（摩爾比）=1︰30，pH 4，浴比1︰50，時間10h。然后用去離子水沖洗干凈，晾干。不含氨基的酸性染料/甲醛復合對蠶絲染色實驗采用相同方法。

皂洗條件：皂片5g/L，浴比1︰75，溫度60℃，時間30min。然后用去離子水沖洗干凈，晾干。

1.2.2DMF剝色實驗

染色蠶絲織物經DMF剝色的方法來檢測Mannich反應修飾中染料和蠶絲之間的共價鍵結合方式。其中剝色溫度為70℃，剝色時間30min，剝色浴比1︰75。

1.2.3甲醛處理蠶絲實驗

配置不同摩爾濃度（1、20、50、70、100mmol/L）的甲醛溶液，用乙酸和乙酸鈉調節pH 4，溫度30℃，時間10h。

1.2.4溴化鋰溶解蠶絲實驗

溶解處理條件：溫度90℃，溴化鋰10g，去離子水30mL。甲醛處理蠶絲的條件：甲醛（100mmol/L）處理蠶絲12h，溫度30℃。

1.2.5甲醛與氨基酸反應實驗

為模擬甲醛與蛋白質中氨基酸殘基的反應，采用如下反應條件：摩爾比為n（醛）：n（氨基酸）=3︰1，用乙酸和乙酸鈉調節pH 4，溫度30℃，時間10h。

1.2.6表觀色深值測試

采用美國SF600-PLUS測色配色儀測試織物的K/S值，D65光源，10°視場。測試樣品折疊8層，3次測量取平均值。

1.2.7蠶絲織物含醛殘留量測試

將芳伯胺染料/甲醛修飾皂洗后的蠶絲織物分3組，剪碎放在40℃的水浴中萃取一段時間，加入乙酰丙酮顯色，用分光光度計在416nm的波長下測試其吸光度。樣品吸光度的計算如下式所示：

A=As-Ab-Ad（1）

式中：A為校正吸光度；As為試驗樣品中測得的吸光度；Ab為空白試劑中測得的吸光度；Ad為空白樣品中測得的吸光度。

設計三組平行實驗，對校正后的吸光度數值取其平均值，對照標準的甲醛工作曲線，查出甲醛的含量，計算出紡織品上游離的甲醛含量。

1.2.8蠶絲溶解度測試

將未溶解的蠶絲用濾紙進行過濾，將未溶物用去離子水清洗，干燥，稱量，得到未溶物的干態質量，并由此計算蠶絲的溶解率[8]。計算公式為：

S/%=W0-W1W0×100（2）

式中：S為蠶絲的溶解率，%；W0為實驗中初始蠶絲的干態質量，g；W1為未溶解物烘干后的總干態質量，g。

1.2.9質譜分析

采用美國LCQ Fleet質譜儀，離子源：ESI；離子化模式：正、負離子；質荷比范圍：m/z 100～2000。

1.2.10紅外光譜分析

采用傅里葉變換光譜技術，使用ATR法在測定甲醛處理后蠶絲的紅外光譜圖，DTGS監測器，測試波數范圍：4000～400cm-1。

1.2.11織物性能測試

拉伸強度：按照GB/T3923.1—2013《紡織品 織物拉伸性能 第1部分：斷裂強力和斷裂伸長率的測定（條樣法）》測試；

折皺回復性：按照GB/T3819—2013《紡織品 織物折痕回復性的測定 回復角法》測試；

織物含醛殘留量：按照GB/T2912.1—2009《紡織品 甲醛的測定 第1部分：游離和水解》測試。

2結果與分析

2.1芳伯胺染料/甲醛復合修飾蠶絲及其顯色作用

將自制的修飾顯色劑芳伯胺染料與甲醛復合同浴修飾蠶絲織物后，進行皂洗去除黏附在纖維表面的芳伯胺染料和醛，然后進行DMF剝色處理，修飾后著色織物的色深值K/S值如圖4所示。同樣，把不含芳伯胺結構的酸性橙Ⅱ在相同條件下與甲醛同浴處理蠶絲纖維，然后進行皂洗和DMF剝色，色深值變化也作于圖4進行對比。

芳伯胺染料D3與不含芳伯胺結構的酸性橙Ⅱ分別與甲醛復合處理蠶絲纖維后，蠶絲織物經過皂洗和DMF剝色后產生了不同程度的色深值變化。從圖4可以看出，芳伯胺染料在低溫條件下與醛復合修飾蠶絲織物，皂洗前蠶絲織物K/S值為10.26，皂洗后為9.30，再經DMF剝色后蠶絲織物的K/S值為8.37。芳伯胺染料在低溫條件下與醛復合修飾能夠使染料在蠶絲織物上獲得比較高的著色性和較好的結合牢度，說明染料與纖維形成共價鍵結合[3，9]。而不含芳伯胺的酸性染料橙Ⅱ在皂洗前K/S值為12.31，獲得高于芳伯胺染料的色深值，而皂洗后的K/S值為1.97，經過進一步DMF剝色處理后K/S值只有0.89。

采用芳伯胺染料作為修飾顯色劑，在蠶絲蛋白的顯色和剝色處理現象中可以看出反應是否發生了共價鍵結合，由圖4可知低溫處理條件下不含芳伯胺的酸性染料只有少量與蠶絲以離子鍵結合，而未能形成穩定的共價結合。因此，可以看出芳伯胺染料結構中芳伯胺的氨基在其修飾蠶絲中具有至關重要的作用，從而佐證了芳伯胺染料與蠶絲素蛋白在甲醛參與下發生了Mannich反應，形成了穩定的共價鍵結合。

2.2蠶絲織物含醛殘留量分析

為了檢測芳伯胺染料/甲醛復合修飾蠶絲皂洗后織物上殘留的游離甲醛含量，參照1.2.7含醛殘留量的測試方法，測試芳伯胺染料D3與甲醛通過復合修飾法獲得的蠶絲織物含醛殘留量的結果如表1所示。由表1可知，芳伯胺染料與甲醛復合獲得的蠶絲織物上的甲醛殘留量三組測試值均小于75mg/kg。根據GB18401—2010《國家紡織產品基本安全技術規范》對紡織品（包括面料和輔料）中所含的甲醛的限定標準規定，直接接觸皮膚的為75mg/kg；非直接接觸皮膚類為不超過300mg/kg。因此，芳伯胺染料/甲醛復合修飾的蠶絲織物可制作直接接觸皮膚類、非直接接觸皮膚類及裝飾類的其他標準規格的用品，例如應用型的蛋白質材料等。

2.3芳伯胺染料/甲醛復合修飾對蠶絲織物物理機

械性能的影響雖然在甲醛參與下修飾顯色劑芳伯胺染料與蠶絲素蛋白可以發生Mannich反應，形成穩定的共價鍵結合，但考慮到在修飾過程中甲醛對蠶絲素蛋白同時具有交聯作用，這個過程也會影響蠶絲素蛋白的結構和性能。為此，采用不同摩爾濃度的甲醛溶液處理蠶絲，測試其物理機械性能，考察其對蠶絲織物的斷裂強力、斷裂伸長率和折皺回復角的影響，測試數據見表2。由表2可知，在甲醛摩爾濃度100mmol/L以下時，處理后蠶絲織物的斷裂強力隨著甲醛濃度的增大而迅速增大，并在70mmol/L后變化趨于平緩；但蠶絲織物斷裂伸長率變化不明顯。甲醛處理后織物的折皺回復角相對于原織物有所提高，在甲醛摩爾濃度50mmol/L時達到最高，進一步增加后反而下降，但仍高于未處理蠶絲織物。由上述結果可知蠶絲織物的斷裂強力和折皺回復角增加，可以推測甲醛在蠶絲蛋白大分子間形成了一些穩定的共價交聯；而斷裂伸長率沒有太明顯的變化，分析認為是由于蠶絲的無定型區較大，盡管形成了一些分子間的交聯，蠶絲受拉伸作用時大分子鏈段間的相對滑移沒有受到明顯的影響。

2.4芳伯胺染料/甲醛復合修飾對蠶絲溴化鋰溶解

性能的影響為了研究甲醛溶液對蠶絲的溶解性和大分子結構穩定性的影響，在相同條件下，將未處理的蠶絲和在100mmol/L甲醛溶液中處理過的蠶絲采用溴化鋰溶液進行溶解對比實驗，測試并對比兩者的溶解速率，結果如圖5所示。將未處理的蠶絲和甲醛溶液處理后的蠶絲在溴化鋰溶液進行溶解，溶液中的溴化鋰水溶液逐步進入蠶絲纖維中，破壞分子間的范德華力和氫鍵等結合力，把分子鏈拆開，形成孤立的大分子而使之全部溶解[10]。由圖5可知，未處理的蠶絲樣在90℃溴化鋰水溶液中經過2h即可完全溶解。但經甲醛處理后的蠶絲織物，需要經過4h才能完全溶解，溶解時間變長。分析認為是由于甲醛處理后蠶絲大分子之間形成的共價交聯，使其不易被溴化鋰水溶液溶解。

2.5甲醛與氨基酸發生共價交聯的質譜分析

以某些活潑氨基酸（色氨酸、精氨酸）模擬蠶絲素蛋白氨基酸殘基（氨基）與甲醛溶液反應，探究甲醛與蠶絲蛋白的交聯機理，其中推導色氨酸與醛的交聯反應式如圖6所示。在Mannich反應修飾蛋白質中采用的甲醛，可以通過橋接作用與氨基酸的氨基以共價鍵形式相連，生成Mannich反應的中間產物席夫堿，在酸性條件下，甲醛容易與色氨酸上的殘基發生反應生成羥甲基加合物A，再發生縮合反應生成席夫堿B[11]。從而甲醛和氨基酸的氨基反應形成活潑的中間體，再進一步與色氨酸發生反應，形成交聯，再和一分子甲醛縮合生成產物C，其理論相對分子質量432.18。研究表明，色氨酸與甲醛先結合形成羥甲基化產物再脫去一分子的水，反應生成的席夫堿結構不穩定又進一步發生分子間縮合[12-13]。

對色氨酸與甲醛模擬反應液進行質譜分析，其結果見圖7。從圖7可以看出，在質譜ESI負模式下，色氨酸與甲醛反應液的質譜圖中有較強的[M—H]-準分子離子峰m/z 431.19和[M—2H]2-/2分子離子峰m/z 215.16，其中215.16是由于產物中含有兩個—COOH，極易失去兩個H質子產生的雙電荷離子峰，而431.19在負模式下產物C失去H質子后，相對分子質量減1，實際相對分子質量為432.19，與理論推測產物C的相對分子質量相吻合。

精氨酸與甲醛的反應原理與色氨酸的相同，但是由于精氨酸中含有較多的氨基，在與甲醛反應時，每一分子的精氨酸消耗了兩分子的甲醛。在酸性條件下，兩分子甲醛與一分子精氨酸上的殘基發生反應生成羥甲基加合物，再發生縮合反應生成席夫堿，并脫去兩分子的水分子，從而甲醛和精氨酸的氨基反應形成活潑的中間體席夫堿。再進一步與精氨酸發生反應，形成交聯，推測其交聯反應式，如圖8所示。

對精氨酸與甲醛模擬反應液進行質譜分析結果見圖9。從圖9可以看出，精氨酸與甲醛反應液ESI質譜圖的負模式中出現很強的[M—H]-準分子離子峰m/z 197.00。精氨酸為堿性氨基酸，分子中含有四個—NH2，所以氨基活性較高，容易被甲醛的活潑C原子進攻。出現有很強的[M—H]-準分子離子峰m/z 197.00，則生成的產物D的實際相對分子質量為198.00。一分子精氨酸與兩分子的甲醛反應脫去兩分子的水剛好是198.00。然后依次出現有很強的[M—H]-分子離子峰m/z 395.05，593.15，692.31，791.16，989.27，1188.18，1385.61，1584.34。依次與產物D成遞增倍數關系，形成了大分子的交聯產物。相對于色氨酸來說，在甲醛的作用下，精氨酸由于分子內含有多個氨基，其使蠶絲蛋白大分子的交聯反應更劇烈，造成的蠶絲蛋白交聯更為復雜，容易形成大分子鏈段之間的交聯。

2.6甲醛與氨基酸發生共價交聯的紅外光譜分析

為了進一步研究甲醛與蠶絲蛋白的交聯反應，采用100mmol/L甲醛處理的蠶絲與未處理的蠶絲對比紅外譜圖，如圖10所示。由圖10可知，1228cm-1譜帶歸屬于蠶絲蛋白酰胺Ⅲ帶中無規線團（構成無定形區）的特征吸收，1510cm-1為酰胺Ⅱ的—NH—的變形振動[14-15]。1610cm-1峰屬于酰胺鍵的特征吸收峰之一（又稱酰胺Ⅰ帶）。1069cm-1屬醚鍵特征吸收峰。甲醛處理后蠶絲出現了新峰2925cm-1和2862cm-1對應的為—CH3，—CH的伸縮振動峰。甲醛處理后相對比未處理的蠶絲出現的兩個新峰，分析認為是由于甲醛與蠶絲氨基酸殘基的氨基發生羥甲基化反應所形成的新峰，也可能是由于甲醛溶液處理蠶絲后交聯形成—CH2—所導致的。

3結論

對脫膠精練過的蠶絲織物在低溫條件下采用芳伯胺染料/甲醛組分復合處理，通過DMF剝色，證明了芳伯胺染料/醛組分復合可以通過Mannich反應對蠶絲素蛋白進行顯色性修飾，并形成穩定的共價鍵結合。除此顯色性修飾之外，在不含芳伯胺染料修飾顯色劑情況下，測試甲醛溶液處理蠶絲后其物理機械性能的變化和溶解性能，揭示了上述修飾作用的同時，甲醛對蠶絲纖維的物理機械性能造成了一定的影響，使蠶絲織物的斷裂強力和折皺回復角提高，而斷裂伸長率沒有太明顯的變化，甲醛處理后的蠶絲素蛋白的耐溴化鋰水溶液溶解穩定性得到提高。通過紅外光譜、質譜分析等測試分析，發現甲醛與色氨酸及精氨酸復合處理后，甲醛與蠶絲蛋白氨基酸殘基間發生了交聯反應。研究結果為進一步開展蛋白質材料的Mannich反應修飾提供一定的理論依據。

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