黑曲霉缺失突變體菌株ΔsodC的構建

付松

摘要 為探究黑曲霉中的超氧化物歧化酶編碼基因sodC在其抗氧化代謝方面所起的作用，構建得到黑曲霉缺失突變體菌株ΔsodC。根據同源重組的技術原理，以黑曲霉基因組DNA為模板，擴增獲得目的基因sodC的上下游側翼片段，利用重疊序列對上下游片段進行PCR連接。將該片段與質粒pC3進行連接，并將其轉入DH5α感受態細胞，通過藍白斑篩選及PCR鑒定，得到已構建成功的重組質粒。通過CaCl2/PEG轉化法將重組質粒轉入黑曲霉原生質體。通過多步驟的篩選及基因組DNA序列的檢測，得到所需突變體菌株ΔsodC以備后續研究使用。

關鍵詞 黑曲霉；缺失突變體；超氧化物歧化酶；同源重組

中圖分類號：Q933 文獻標識碼：A 文章編號：2095-3305（2018）03-001-02

DOI： 10.19383/j.cnki.nyzhyj.2018.03.001

Abstract In order to investigate the role in terms of the gene sodC in the antioxidant metabolism in Aspergillus niger，the deletion mutant ΔsodC was constructed. According to the principal of homologous recombination，the upstream and downstream flanking fragments of the gene sodC were amplified by using the genomic DNA of Aspergillus niger as template. Then the upstream and downstream flanking fragments were connected with PCR by using overlapping sequences. The fragment ABCD was connected with plasmid pC3 and transferred into the DH5α competent cells. The recombinant plasmid pC3ABCD was constructed successfully by blue spot screening and PCR identification. The recombinant plasmid was transferred into protoplast of Aspergillus niger by CaCl2/PEG transformation method. Through multistep screening and the detection of genomic DNA sequences，we could get the deletion mutant ΔsodC，which could be used for the future research.

Key words Aspergillus niger； Deletion mutant； Superoxide dismutase； Homologous recombination

黑曲霉（Aspergillus niger），曲霉屬真菌中的一個常見種。它廣泛分布于土壤和植物性產物中，既是重要的工業發酵菌種，但同時也是一種能導致糧食霉變的致病真菌。從20世紀90年代開始，分子生物學的進步拉開了研究黑曲霉的序幕[1]。一些針對真菌的分子生物學操作手段如敲除載體、轉化法、篩選標記等被用到了黑曲霉中[2]。這些工作都為更好地研究黑曲霉的基因功能奠定了基礎。

超氧化物歧化酶（SOD，superoxide dismutase，EC 1.15.1.1）是一種重要的抗氧化金屬酶類。生物體中主要有3種SOD類型，根據所含離子的不同，分為Cu/ZnSOD，FeSOD和 MnSOD。真核生物含有位于線粒體的MnSOD和位于細胞質的Cu/ZnSOD。Cu/ZnSOD是真核細胞細胞質中常見的一種超氧化物歧化酶，它由2個亞基組成，每個亞基分別含有1個銅離子和1個鋅離子[3]。已知在釀酒酵母和白色念珠菌中，Cu/ZnSOD （SOD1，也被叫作CCS1） 在抵抗氧化脅迫方面具有重要的作用[4]。但是黑曲霉中基因sodC在氧化脅迫條件下所起的作用尚不清楚。

絲狀真菌的遺傳學研究常存在多種問題，如同源重組率較低，篩選標記的選擇等。此外，絲狀真菌由于具有復雜的細胞壁結構等，外源基因進入并整合到染色體上的頻率并不高[5]。提高轉化效率是絲狀真菌基因工程研究中亟待解決的問題。筆者利用CaCl2/PEG介導的原生質體轉化法[6-7]，成功構建了黑曲霉突變體菌株ΔsodC。

1 材料與方法

1.1 菌株、質粒和培養條件

試驗所使用的黑曲霉Aspergillus niger MA70.15（ΔkusA，pyrG-）和質粒 pC3（pyrG+）由安徽豐原生物化學股份有限公司實驗室提供。黑曲霉生長在28℃葡萄糖土豆瓊脂培養基（PDAUri）上或PDA液體培養基上，含200 g/L土豆，20 g瓊脂，20 g葡萄糖和10 mmol/L尿苷。

1.2 黑曲霉sodC基因敲除載體的構建

首先從黑曲霉基因組數據庫中獲取sodC基因序列，然后再選取基因sodC上下游1 500 bp左右的片段，并進行酶切位點及保護堿基的添加來設計合適的2對引物A、B和C、D。引物序列見表1。

參照“MasterPure Yeast DNA Purification Kit”使用說明，提取黑曲霉MA70.15菌株的基因組DNA。以黑曲霉基因組DNA為模板，利用2對引物A、B和C、D，擴增獲得sodC目的基因的上下游側翼片段AB和CD。利用重疊序列對上下游片段進行PCR連接，得片段ABCD。將該ABCD片段與質粒pC3進行連接，得重組質粒pC3ABCD，并將其轉入DH5α感受態細胞，通過藍白斑篩選及雙酶切鑒定，得到正確的基因敲除載體pC3ABCD。

1.3 黑曲霉原生質體制備及聚乙二醇轉化

制備黑曲霉原生質體，并參考Ballance等的方法，對原生質體進行聚乙二醇（PEG）介導的轉化[8-9]。首先將黑曲霉MA70.15菌株接種到PDAUri固體培養基上培養（28℃恒溫培養4 d），將所得孢子接種到PDAUri液體培養基中（20 ml），30℃，150 r/min，振蕩培養過夜，收集并清洗培養物。室溫下離心（3 000 r/min，5 min），收集孢子。用無菌的0.7 mol/L NaCl溶液（3 ml）重懸孢子，室溫下離心（3 000 r/min，5 min），棄上清，避免去除沉淀。反復3次，達到清洗菌體的目的。隨后在100 ml無菌錐形瓶中加入10 ml溶壁酶溶液及7 ml孢子懸浮液（107個/ml），37℃，70 r/min，對孢子細胞壁進行裂解3 h。每1.5 h用顯微鏡對孢子裂解情況進行觀察。至孢子裂解為原生質體后，用無菌的4層擦鏡紙對其進行過濾，得濾液，對其進行離心（4℃，20 000 r/min，10 min），小心去上清，留沉淀。用3 ml山梨醇TrisHCl（STC）溶液洗滌，離心（4℃，3 000 r/min，5 min）。后用700 ml STC重懸，輕柔吹吸，置于冰中待用。原生質體轉化：200 μl原生質體（106個/ml），加20 μl重組質粒pC3ABCD和50 μl PEG轉化緩沖液于10 ml離心管，溫和混勻，冰浴20 min。

再加1 ml PEG轉化緩沖液，溫和混勻，室溫下靜止5 min，再加2 ml STC，溫和混勻。將所得混合液體，直接倒入上層篩選培養基中，混勻，倒入2個下層篩選培養基中。待凝固后，將其放在恒溫培養箱，28℃，倒置培養。

1.4 黑曲霉sodC缺失體的篩選及鑒定

參照 Delmas 等的方法，進行后續篩選。挑取上一步中已長出的黑曲霉單克隆的孢子（含質粒 pC3ABCD），經過2次MM固體培養基的培養（28℃恒溫培養4 d），進行純化。后將所得孢子接種到PDAUri固體培養基上（28℃恒溫培養4 d），經2次培養。將上一步培養所得的孢子涂布到MMUri5FOA（1%葡萄糖，1.6 mmol/L尿苷，750 μg/ml 5-氟-乳清酸）固體培養基中，28℃恒溫培養3 d。將所得的孢子用MMUri5FOA液體培養基進行培養（28℃，250 r/min，搖床振蕩培養3 d）。最后，提取黑曲霉菌絲體的基因組DNA對其基因序列進行檢測。

2 結果與分析

2.1 sodC側翼片段AB、CD和ABCD的PCR合成及純化

以黑曲霉MA70.15基因組DNA為模板，進行PCR擴增（圖1），所得產物大小分別為上游片段AB 902 bp，下游片段CD 520 bp，與理論值相符。對片段AB、CD分別進行切膠純化，得純化后的片段AB和CD，大小與理論值相符。后進行片段AB和CD的PCR連接，所得產物片段ABCD及純化后的片段均約為1 400 bp（圖1）。

2.2 sodC側翼片段ABCD和pC3質粒的連接及鑒定

將sodC側翼片段ABCD進行EcoR I/Xho I雙酶切，純化后的片段與雙酶切后的pC3載體進行連接。對所得到的pC3ABCD質粒分別進行PCR鑒定及EcoR I/Xho I雙酶切鑒定。由圖2可見，所得PCR鑒定產物大小約為1 400 bp，與理論值相符。質粒pC3產物大小約為5 850 bp，與理論值相符。對重組質粒pC3ABCD進行雙酶切，發現產物有2條帶，上方的為pC3載體，大小約為5 850 bp；下方的條帶為片段ABCD，大小約為1 400 bp，大小與理論值相符。說明sodC基因敲除載體pC3ABCD已構建成功。

2.3 黑曲霉sodC缺失體的鑒定

重組質粒pC3ABCD被轉入到黑曲霉原生質體內，經過多重篩選，得轉化株。后提取野生型及轉化株的基因組DNA對其基因序列進行檢測，結果顯示所得突變體菌株ΔsodC中的基因sodC確已敲除。

3 結論

試驗基于重組質粒與染色體同源重組原理，對絲狀真菌黑曲霉進行基因敲除。在此，使用的母本菌株為黑曲霉Aspergillus niger MA70.15（ΔkusA，pyrG-）菌株。其中pyrG基因，編碼5氟乳清酸脫羧酶，作為一種雙向篩選標記基因[10]，可以重復使用這一標記，最終使基因組中去除該標記基因[11]。事實上，缺乏這種酶的細胞不能在沒有尿苷或尿嘧啶的條件下生長，但這些細胞可以抵抗5氟乳清酸的毒性。此外，所缺失的kusA基因（編碼 Ku70 的同源蛋白），它的缺失不影響黑曲霉的生長，卻能大大降低非同源末端連接的效率并提高同源重組率[12]。這兩點正是此次構建突變體的關鍵所在。

參考文獻

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責任編輯：鄭丹丹