鎂基抗菌織物抗菌性能測試研究

沙林 王瀅 李倩 朱益民 王寧會 趙嬌

摘要：國內(nèi)外對紡織品抗菌性能的評價各不相同，對不同類別的紡織品也沒有公認和統(tǒng)一的測試標準，因此采用恰當?shù)膶嶒灧椒▽︽V基抗菌織物進行測試，能夠保證測試結(jié)果的準確性。采用改良AATCC100法和改良振蕩法對鎂基抗菌織物的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌抗菌性能進行測試。結(jié)果表明：鎂基抗菌織物對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌率均在90%以上，且兩種方法所得結(jié)果接近、結(jié)論相同。鎂基抗菌織物對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌具有良好的抑菌效果。

關(guān)鍵詞：鎂基抗菌織物；測試標準；改良AATCC100；改良振蕩法；抑菌率

中圖分類號：TS195.5文獻標志碼：A文章編號：1009-265X（2018）03-0066-05Study on the Antibacterial Property of MagnesiumBased Antibacterial Fabrics

SHA Lin1， WANG Ying1， LI Qian1， ZHU Yimin1， WANG Ninghui2， ZHAO Jiao1

（1.Institute of Environmental Remediation， Dalian Maritime University， Dalian 116026； 2.Institute of

Environmental Electrical Engineering， Dalian University of Technology， Dalian 116023）Abstract：At present， the methods to evaluate antibacteria property of textiles are different at home and abroad. There are no recognized and unified testing standards for different textiles. In order to ensure the accuracy of test results， appropriate test methods should be chosen to test magnesiumbased antibacterial fabric. Improved AATCC100 and improved oscillation method were applied to test antibacterium capability of magnesiumbased antibacterial fabrics for E.coli and Staphylococcus aureus. The results show that the bacteriostatic rate of the magnesiumbased antibacterial fabrics for the two kinds of bacteria is above 90%. And the results and conclusions gained by both methods are similar. The magnesiumbased antibacterial fabrics have obvious antibacterial effect on E.coli and Staphylococcus aureus.

Key words：magnesiumbased antibacterial fabrics； test criteria； improved AATCC100； improved oscillation method； bacteriostatic rate

通信作者：朱益民，Email：ntp@dlmu.edu.cn鎂基抗菌織物是通過浸軋、涂層的方式將氫氧化鎂附著于織物表面而形成的一種環(huán)境友好型抗菌織物。Mg（OH）2對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌都有良好的抗菌特性[1]。其抗菌主要通過ROS氧化損傷機理，即Mg（OH）2離解出過氧負離子（O-2），O-2有強氧化性，可以氧化細胞組分及蛋白質(zhì)等[2]。另外，Mg（OH）2的表面由于包覆一層OH-而呈堿性，而O-2在堿性環(huán)境中具有較高的化學(xué)穩(wěn)定性，因此產(chǎn)生的O-2容易在其表面富集，使其表面的O-2濃度較高，阻礙了細胞正常的物質(zhì)交換過程，從而導(dǎo)致細胞死亡[35]。

近幾年國內(nèi)外市場研制并生產(chǎn)了大量的抗菌織物產(chǎn)品，然而產(chǎn)品質(zhì)量良莠不齊，因此如何正確的檢測并評價出這些產(chǎn)品的抗菌性能，促進功能性紡織品市場良好的發(fā)展和保障消費者權(quán)益就顯得尤為重要。對目前國內(nèi)外使用紡織品抗菌性能測試方法進行深入分析，測試思路有兩種，第一種是試樣法，即將菌液滴加到試樣上，一段時間內(nèi)在試樣上直接進行抗菌過程，然后通過比較試樣處理前后洗脫液培養(yǎng)的菌落數(shù)、pH值、顏色等參數(shù)衡量織物的抗菌性能。第二種是菌液法，即將試樣置于菌液中，一段時間內(nèi)在菌液體系中進行抗菌過程，通過比較處理前后菌液的相關(guān)參數(shù)如OD值的變化來評價織物的抗菌性能。由上可知抗菌紡織品的測試原理主要分兩步，一是菌體與織物的接觸過程，即織物抗菌過程；一是檢測活菌過程。

國內(nèi)外針對紡織品抗菌性能的檢測方法有很多，定性測試方法主要有美國AATCC 90（暈圈法或瓊脂平皿法）[6]、美國AATCC30試驗法[7]、日本JISZ 2911抗霉菌試驗法、中國GB/T 20944.1—2007《紡織品抗菌性能的評價第一部分：瓊脂平皿擴散法》[8]等。定性實驗是通過抗菌劑離開纖維進入培養(yǎng)皿后對菌體的抗性作用，一般適用于溶出型抗菌織物，而不適用于非溶出型抗菌織物，優(yōu)點是費用低，檢測速度快，但實驗結(jié)果只能定性判斷織物是否具備抗菌性能，不能準確給出抗菌率。定量測試的方法主要有美國AATCC100[9]、美國材料協(xié)會ASTM E2149試驗法振蕩法[10]、日本JIS LI902—2008[11]、中國FZ/T 01021—1992《織物抗菌性能實驗方法》[12]、改良奎因法（Quinn）實驗法[13]、GB/T 20944.3—2008《紡織品抗菌性能的評價第三部分：振蕩法》[14]、GB/T 209944.2—2008《紡織品抗菌性能的評價第二部分：吸收法》等[15]。其中AATCC100和振蕩法是目前應(yīng)用的主要方法，這幾種方法均適用于溶出型和非溶出型織物，并且可以定量、準確、客觀的評價織物的抗菌性能。

AATCC100法在實驗過程中存在的缺點：一次檢驗樣少；非溶出型試樣不能進行抗菌性能的評價；中和液成分不詳細；容器過大，不易操作；菌液中營養(yǎng)過于豐富，與織物實際應(yīng)用情況不符[16]。本研究對以上缺點加以改進，可以滿足不同類型抗菌織物的性能測試。

振蕩法可以適用于大多數(shù)試樣，如毛羽類衣物、粉末狀、表面凹凸不平的織物、非溶出型織物等[17]。但該法的缺點是培養(yǎng)液中缺乏菌體生長必須的營養(yǎng)物質(zhì)，得到的抗菌率不精準；培養(yǎng)時間短，菌體幾乎不增殖，與實際使用情況不符；振蕩培養(yǎng)的溫度只有25 ℃，達不到菌體生長最適溫度[18]。

根據(jù)以上國內(nèi)外測試方法和測試原理，本研究采用改良AATCC100和改良振蕩法對鎂基抗菌織物抗菌性能進行測試，使培養(yǎng)溫度更適合菌體生長，培養(yǎng)時間充分，操作方法簡單易行，菌種選用更符合實際應(yīng)用。

1實驗

1.1實驗菌種

實驗采用大腸桿菌（8099）和金黃色葡萄球菌（CTCC 10384），菌種來自中國普通工業(yè)微生物菌種保藏中心。

1.2實驗材料

鎂基抗菌織物PET3C、COTT1、COTT2；空白對照織物：滌綸、純棉白坯布。

1.3實驗設(shè)備

實驗所用到的設(shè)備如表1所示。

1.4實驗方法

1.4.1接種菌液制備

從第3～14代的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面新鮮培養(yǎng)物上取一環(huán)細菌，在0.5%的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)20～24 h，培養(yǎng)溫度為（37±1）℃。取300 μL活化菌懸液加入30 mL的LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)8 h后，用0.85%生理鹽水作為緩沖溶液稀釋菌液以達到所需濃度。

1.4.2改良AATCC100法

實驗過程：在超凈工作臺上將接種液用0.85%生理鹽水進行稀釋，用平板菌落計數(shù)法將菌液濃度確定為1×105～2×105 cfu/mL。

將空白對照織物、鎂基抗菌織物各取邊長為1.8 cm的正方形試樣3份，每份的試樣數(shù)量以能夠完全吸收1 mL菌液為限，分別用紙巾包好置于高壓滅菌鍋中，121 ℃滅菌20 min。將所有待測樣品分別放置在已滅菌的培養(yǎng)皿中，移液槍吸取1 mL菌液均勻、完全的接種在各試樣上，并在每個培養(yǎng)皿中放置一塊吸飽和生理鹽水的滅菌脫脂棉，以保持濕潤的生長環(huán)境，（37±1）℃恒溫培養(yǎng)。接觸抗菌24 h后對試樣用20 mL，0.85%的生理鹽水進行菌體洗脫。將洗脫液采用10倍稀釋法，每次取100 μL進行平皿涂布，（37±1）℃恒溫培養(yǎng)24 h后，用平板菌落計數(shù)法進行計數(shù)。用式（1）計算試樣的抑菌活性：

抑菌率/%=Xa-XbXa×100（1）

式中：Xa—培養(yǎng)24 h后空白對照樣活菌數(shù)，cfu/mL；Xb—培養(yǎng)24 h后試樣活菌數(shù)，cfu/mL。

遵循AATCC100的測試原理，改良AATCC100法較AATCC100主要從以下幾個方面做了實驗改進：a）將試樣直徑4.8 cm的圓形改為邊長為1.8 cm的正方形，便于接種菌液時能夠準確的確定完全吸收接種液的試樣數(shù)量；b）用（37±1） ℃的0.85%生理鹽水代替AATCC100中的肉湯接種液，避免菌液中的營養(yǎng)過多與實際應(yīng)用條件相差較大，并將菌液稀釋為1×105～2×105 cfu/mL；c）在洗脫試樣時，為了避免洗脫液成分與菌液生長的營養(yǎng)環(huán)境差異較大而引起細菌數(shù)目的增多或減少，用20 mL，（37±1） ℃的0.85%生理鹽水代替成份不明確的洗脫液洗滌試樣；d）試樣不在錐形瓶接種菌液，而是放入100 mm×15 mm的無菌培養(yǎng)皿中接種菌液，這樣既避免了在轉(zhuǎn)移試樣的過程中染菌，同時也方便了實驗操作；e）接菌后培養(yǎng)皿中放入一塊飽含生理鹽水的脫脂棉，保持菌體生長環(huán)境濕潤，保溫箱保溫培養(yǎng)18～24 h。

1.4.3改良振蕩法

實驗過程：將所有試樣剪成邊長1 cm的正方形，稱取0.75 g放入250 mL的帶塞燒瓶中，每一試樣稱取3組平行樣，121 ℃滅菌20 min備用。

將制備的菌懸液濃度用0.03%的磷酸緩沖溶液調(diào)至1×104～3×104 cfu/mL。取1 mL稀釋好的菌懸液和50 mL 1‰的磷酸鹽肉湯稀釋液于滅菌的燒瓶中，空白對照樣立刻在250～300 r/min條件下振蕩1 min，然后取100 μL進行涂平板，（37±1）℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，用平板菌落計數(shù)法進行計數(shù)，結(jié)果記為“0”接觸時間燒瓶內(nèi)活菌濃度。

然后將剩余燒瓶放入恒溫培養(yǎng)振蕩器中，（37±1）℃，120 r/min，培養(yǎng)（20±2）h。采用0.85%的生理鹽水將菌液按10倍稀釋法進行稀釋，每次取100 μL進行涂平板，然后放置于恒溫培養(yǎng)箱中，（37±1）℃，培養(yǎng)18 h，計算菌落數(shù)，結(jié)果記為培養(yǎng)后的細菌數(shù)。

根據(jù)式（2）計算試驗菌的增長值F，對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌等細菌，當F值大于或等于1.5，且空白對照燒瓶中的活菌濃度比接種時的活菌濃度增加時，試驗判定為有效，否則無效。

F=lgA-lgB（2）

式中：F—對照樣的試驗菌增長值；A—3個空白對照樣接種并培養(yǎng)18 h后的細菌平均值cfu/mL；B—3個空白對照樣“0”接觸時間燒瓶內(nèi)活菌濃度平均值，cfu/mL。

根據(jù)式（3）計算恒溫振蕩培養(yǎng)18 h后抗菌織物抑菌率。

抑菌率/%= （A-C）/A×100（3）

式中：C—3個抗菌織物試樣接種并培養(yǎng)18 h后測得燒瓶內(nèi)活菌濃度平均值，cfu/mL。

改良振蕩法結(jié)合FZ/T 73023、GB/T 20944.3和AATCC100的優(yōu)點，在實驗方法上做出如下改進：a）將振蕩培養(yǎng)溫度由FZ/T 73023、GB/T 20944.3中的（24±1）℃改為細菌生長的最適溫度（37±1）℃；b）對比FZ/T 73023、GB/T 20944.3，在菌液濃度相同的條件下，改良振蕩法中將原有的5 mL接菌液和70 mL振蕩液改為1 mL接菌液和50 mL振蕩液，使實驗操作更簡便；c）振蕩時間由GB/T 20944.3中的18 h延長到（20±2） h，以使抗菌織物中的抗菌劑完全釋放出來；d）為了避免菌體隨著振蕩時間的延長而缺乏營養(yǎng)死亡，將磷酸鹽緩沖溶液改為1‰磷酸鹽肉湯稀釋液；e）將振蕩培養(yǎng)的速度由150 r/min變?yōu)?20 r/min，避免振蕩的速度過快導(dǎo)致菌體死亡。

2結(jié)果與討論

2.1鎂基抗菌織物對大腸桿菌和金黃色葡

萄球菌的抗菌性能測試結(jié)果采用改良AATCC100法和改良振蕩法測試鎂基抗菌織物對大腸桿菌8099和金黃色葡萄球菌ATCC 6538的抑菌實驗，結(jié)果如表2、表3所示。由表2、表3可以看出，改良AATCC100法中，3種鎂基抗菌織物對大腸桿菌的抗菌率為97.1%、95.2%、95.7%，抗菌率均在90%以上；在改良振蕩法的實驗中，經(jīng)試驗驗證，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的細菌增長值≥1.5，3種鎂基抗菌織物對大腸桿菌的抑菌率為96.9%、94.7%、91.9%，鎂基抗菌織物的抑菌效果較強；改良振蕩法實驗結(jié)果與改良AATCC100法的實驗結(jié)果基本相近，可知兩種方法得到的實驗結(jié)果可靠。

2.2影響鎂基抗菌織物抗菌性能測試的關(guān)

鍵因素2.2.1菌液制備

菌液制備為抗菌性能檢測實驗的初始步驟，菌液的質(zhì)量和濃度直接影響到實驗結(jié)果的準確性和可靠性。在實驗過程中，只有活性最高，形態(tài)最穩(wěn)定的菌體，對抗菌織物性能的檢測才最具有代表性。目前國內(nèi)外的制備方法中主要分為兩步法和三步法，所謂的兩步法為：第一步，用接種環(huán)接種保藏菌種，劃線接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)皿中，將平皿置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一段時間；第二步，從第一步的平皿中接種一菌環(huán)細菌于液態(tài)培養(yǎng)基中，37 ℃下培養(yǎng)一段時間，并將菌液濃度稀釋至規(guī)定濃度。三步法是取第二步中的原菌液于液態(tài)培養(yǎng)基中，37 ℃下培養(yǎng)一段時間，最后將菌液濃度稀釋至規(guī)定濃度。本次實驗采用三步法制備菌液。采用三步法的優(yōu)點是較兩步法大大提高了菌液的活性，尤其對于活性較差的金黃色葡萄球菌，菌液質(zhì)量有明顯提高，但對活性較高的大腸桿菌來說變化不大[19]。

由于菌體繁殖會使培養(yǎng)液渾濁，菌懸液的細胞濃度與OD值成正比，用分光光度計測出濁度，用OD值表示菌液濃度。通過特性數(shù)學(xué)分析方法得出大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的最優(yōu)生長活性時間點。

由圖1可知，大腸桿菌培養(yǎng)液的OD值隨著時間的延長呈S型曲線生長，在9 h時，細胞呈對數(shù)形式增長，此時的細胞大小、形態(tài)、生理特征等都較為一致，生長代謝十分旺盛，是制備接種菌液的良好時期。

圖1大腸桿菌接種培養(yǎng)時間與OD值之間的關(guān)系

由圖2可知，金黃色葡萄球菌培養(yǎng)液濃度在前3 h內(nèi)增長緩慢，由于菌體對生長環(huán)境較為敏感，該段時間內(nèi)菌體細胞基本不增殖；3～12 h之間金黃色葡萄球菌菌液OD值迅速增長，其中在7～8 h附近，曲線斜率達到最大，由此可知金黃色葡萄球菌從3 h開始迅速生長，在7～8 h之間，菌體生長速度達到最大值，細胞代謝最旺盛，繁殖能力最強，形態(tài)也較為穩(wěn)定，所以選擇培養(yǎng)7～8 h的金黃色葡萄球菌為接種菌能充分體現(xiàn)出抗菌織物的抗菌特性。圖2金黃色葡萄球菌接種時間與OD值之間的關(guān)系

2.2.2改良AATCC100法中接菌試樣大小與數(shù)量

在AATCC100法中，試樣切成直徑為（4.8±0.1）cm的圓形，將樣品堆疊在250 mL帶有螺旋蓋的廣口瓶中，用于旋加1.0 mL的接種液，然后將試樣轉(zhuǎn)移到帶蓋的廣口瓶內(nèi)恒溫保存。樣品的數(shù)量以完全吸收1 mL菌液為限。該方法在實驗操作過程中，由于試樣面積較大，難以準確的控制吸收1 mL菌液的試樣數(shù)量，并且在接種后轉(zhuǎn)移試樣于廣口瓶的過程中易染菌，試樣易貼壁。為避免以上問題，在改良AATCC100法中，將試樣的大小變?yōu)?.8 cm，于無菌平皿中接菌1 mL，然后直接在平皿中放入飽含生理鹽水的無菌脫脂棉團。改進后的操作步驟可以更加靈活的調(diào)整試樣的數(shù)量，并且減少了試樣貼壁造成的菌液減少。

2.2.3洗脫液制備

在AATCC100法中，試樣接種培養(yǎng)一段時間后進行振蕩洗脫，以將試樣表面剩余活菌洗脫下來。洗脫液營養(yǎng)成分應(yīng)與試樣實際使用環(huán)境相近，并在振蕩過程中使菌體完全洗脫，洗脫液里菌體分散均勻，才能保證菌落計數(shù)時的準確性。在改良AATCC100中，使用37 ℃的0.85%生理鹽水作為洗脫液。洗脫液制備的過程中，要對浸漬在0.85%的生理鹽水中的織物充分振蕩3～5 min，反復(fù)操作振蕩步驟3次，保證每次振蕩力度相同。

3結(jié)論

a）改良AATCC100法和改良振蕩法是檢測織物抗菌特性的具有代表性的兩類方法，相對于AATCC100和振蕩法，實驗參數(shù)更加合理。

b）鎂基抗菌織物作為環(huán)境友好型材料，具備良好的抑菌特性。3種鎂基抗菌織物對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌率均達到90%以上。

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